화공노트: 화학공학 살펴보기

 

 

Ⅰ. Title

크로마토그래피(Chromatography)

 

Ⅱ. Purpose

1. 정상, 역상 크로마토그래피를 이해하고, 이동상과 고정상의 개념을 배운다.

2. TLC와 Columm 크로마토그래피로 색소를 분리함으로써, 크로마토그래피의 원리와 극성의 개념을 배운다.

 

Ⅲ. Theory

1. 혼합물의 분석과 분리

분석 화학에서는 혼합물에 대한 화합물을 직접 분석하는 방법이 있다. EDTA 적정 혹은 각종 분광법이 이에 해당한다. 하지만 불가피하게 혼합물을 직접 분석하지 못하면 분석 물질을 구성하는 각각의 화합물로 분리하는 과정이 꼭 필요하다. 혼합물의 조성 물질의 성분 및 상태에 따라 거름, 증류, 확산, 침전 등을 통해 분리할 수 있다. 그러나 최근에는 크로마토그래피(chromatography)를 통해 혼합물을 분리하는 경우가 많다.

 

2. 물질의 극성과 상호작용

화학결합은 전자의 상호작용으로 인해 발생한다. 결국 어떤 결합을 이루고 있는 물질에 대해서 전기음성도 차이가 극성을 결정하는데 큰 요인으로 작용할 수 있다. 두 원자사이의 전기음성도 차이로 인해서 극성 결합이 형성될 수 있다. 반면 두 원자사이에 전기음성도 차이가 없다면 이는 무극성 결합을 형성한다. 다만 극성 공유 결합이 존재한다고 해서 항상 그 물질이 극성을 갖는 것은 아니다. 원자가 3개 이상 존재할 때 극성 공유 결합을 가지고 있더라도 분자의 구조에 의해서 쌍극자 모멘트가 상쇄되어 전체 쌍극자 모멘트 값이 0을 나타낸다면 이는 무극성 분자이다. 한편, 극성 결합이 있으면서도 기하적 구조가 대칭이 아니라면 알짜 쌍극자 모멘트는 0이 아니며 이는 극성 분자일 것이다. 용질과 용해의 관점에서 엔탈피의 변화 등으로 같은 극성을 갖는 물질이 서로 잘 섞이는 현상을 알 수 있다. 이를 확장하면 물질 사이의 상호작용에도 적용할 수 있다. 분자의 상호작용이 쌍극자 - 쌍극자 모멘트 인력이 분산력보다 더 강한 것을 알 수 있다. 이는 같은 극성을 갖는 물질들끼리 더 강한 상호작용을 하는 것을 알 수 있다. 이는 특히 용해도의 차이를 이용해서 물질을 분리하는 분리 방식 크로마토그래피에서 물질의 분리할 수 있는 주요 원리로 기인하며 TLC에서 전개제를 형성할 때 중요하게 고려되기도 한다.

 

3. 크로마토그래피 (chromatography) 분류와 실험에 해당하는 크로마토그래피 고찰

크로마토그래피를 딱 한마디로 정의하기는 어렵다. 왜냐하면 각 크로마토그래피 기법을 이용해서 혼합물을 분리할 때 주로 사용하는 원리가 다양하기 때문이다. 예를 들어 이동상의 종류를 기준으로 분류하면 액체, 고체 및 기체 크로마토그래피로 분류할 수 있다. 이제 크로마토그래피를 주로 사용하는 원리를 기준으로 분류해보자.

① 흡착 방식 (Adsorption mode): 분리를 위해 충전한 흡착제의 표면에 활성 자리(active site)가 존재한다. 시료가 이동상과 함께 흡착제를 지나갈 때 시료가 선택적으로 활성자리에 흡착된다. 이동상 속의 시료와 활성자리 사이의 수소결합 등 인력과 관련된 상호작용으로 흡착이 발생한다. 시료의 구조 혹은 극성 또한 흡착 여부에 큰 영향을 미친다. 액체-고체 크로마토그래피 혹은 기체-고체 크로마토그래피에서 주로 사용한다.

② 크기 배제 방식 (size exclusion mode): 정지상으로 사용한 다공성 겔이 갖는 물리적 특성을 이용한다. 겔에 의해 발생한 공간사이로 시료를 통과하게 한다. 이때 통과하는 시료의 크기가 작을수록 겔 사이의 틈새에 잘 끼어 이동하기 어려워지는 특성을 이용하여 물질을 분리한다.

③ 친화 크로마토그래피 (Affinity chromatography): 크기가 큰 분자의 분리와 정제를 위해서 다양한 흡착제를 개발하면서 발견했다. 원리는 흡착 크로마토그래피와 유사하며 대게 생물학적 특이성이 부여되어 있다.

④ 분배 방식 (partition mode): 시료 분자들의 이동상과 정지상에 대한 상호작용(용해도)의 차이를 통해서 시료 분자들을 분리한다. 여기서 이동상은 시료와 함께 흐르는 물질을 의미하며, 정지상은 멈추어 있는 물질을 의미한다. 분배 방식의 진행 속도는 앞선 카페인 추출 실험에서 고려했던 분배 계수(distribution coeffeicient)를 이용해서 논의한다. 어떤 물질에 대해서 이동상에 대한 용해도를 Cm, 고정상에 대한 용해도를 Cs라고 하자. 이때 분배계수 K=Cs/Cm으로 정의된다. 고정상이 흐르지 않는 물질, 이동상을 흐르는 물질로 사용하므로 물질의 용해도가 이동상에 대해 높을 때 보다 분리가 빠르게 발생한다. 즉 분배계수의 값이 클수록 이동상에 대해 물질이 쉽게 용해됨을 의미하고 더 빠르게 분리를 할 수 있음을 알 수 있다. 반면 분배계수의 값이 작다면 고정상에 대해 물질이 용해될 수 있으므로 분리가 천천히 일어난다. 혼합물 속의 각 물질들이 서로 다양한 분배계수 값을 가지기 때문에 물질의 분리가 발생한다. 하지만 그렇다고 이동상을 매우 강한 극성 혹은 무극성 물질을 사용하면 안된다. 왜냐하면 극성을 한편으로 치우치게 한다면 자칫 시료에 포함되어 있는 물질조차 용해시키기 못하고 비효율적인 분리 결과를 얻을 수 있기 때문이다. 분배 방식을 이용한 크로마토그래피는 사용하는 용액의 극성에 따라 정상 크로마토그래피와 역상 크로마토그래피로 구분할 수 있다. 이 두 크로마토그래피의 특성을 밑의 표를 통해서 정리해보도록 하자.

	정상 크로마토그래피	역상 크로마토그래피
고정상 극성	높음	낮음
이동상 극성	비교적 낮음	비교적 높음
시료성분의 용출순서	무극성일수록 빠르게 용출	극성일수록 빨리 용출
이동상의 극성을 높인 경우 용출속도	용출되는 속도가 늦어짐 (분배계수가 작아짐)	용출되는 속도가 빨라짐 (분배계수가 커짐)

분배 크로마토그래피의 경우 칼럼(관)을 이용해서 분리하는 경우가 많다. 이 경우, 시료를 위에서 아래로 분리한다. 분리 과정을 방치하더라도 중력에 의해 시료가 밑으로 내려오면서 분리가 진행된다. 하지만, 위에 압력을 가하면 감압 여과와 같이 압력 차를 이용하면 더 빠르게 용액을 분리할 수 있다. 한편, 분배 방식이 물질에 대한 용해도에 대해 논의하는 것을 보아 한가지 주의해야 하는 것을 알 수 있다. 분배 방식을 이용한 크로마토그래피를 진행하면 한 가지 시료에 대해서만 분리가 가능하며, 다른 분리를 위해선 새롭게 장비 설치를 해야 한다. 왜냐하면 분배계수가 무한의 값을 가지지 않다는 것은 일정량의 시료가 고정상에 용해될 수 있음을 의미하며 이는 고정상의 오염이 발생한다는 것을 의미한다. 따라서 이번 실험처럼 2가지 이상의 시료를 분리해야 하는 경우 각각의 분리마다 새롭게 크로마토그래피 장치를 만들어야 한다. 이번 실험 2에서 이용하는 크로마토그래피는 극성 물질인 실리카겔을 고정상으로 사용하는 것으로 보아 정상 크로마토그래피인 것을 알 수 있다. 무극성에 가깝지만 극성부위(-OH)도 가지고 있는 butanol을 이동상으로 하여 혼합물의 물질을 모두 용해할 수 있으며 정지상에 대해 뚜렷한 용해도 차이를 보여 보다 효과적인 분리를 진행할 수 있도록 했다. 효과적으로 분리를 진행하기 위해서 칼럼을 올바르게 준비해야한다. 칼럼에 채우는 충진제의 크기가 균일하고 건조되지 않은 상태를 유지하는 것이 중요하다.

⑤ 얇은 층 크로마토그래피 (thin layer chromatography): 얇은 층 크로마토그래피는 플라스틱 혹은 알루미늄을 지지체로 하여 실리카겔이나 알루미나를 정지상으로 얇게 표면에 코팅한 제품을 이용해서 진행한다. TLC에서 효과적을 물질을 분리하기 위해서 여러 수칙을 지켜야한다. 우선 시료는 주사기나 모세관같이 적은 양을 이동할 수 있는 도구를 이용해서 다른 시료 혹은 표준 물질에 대해 분명히 구분할 수 있도록 떨어트려야 한다. 또한 이동상(전개제)에 시료가 닿아 오염되는 일이 없도록 액체의 표면보다 높은 위치에 시료를 떨어트린다. TLC는 단면과 분배계수가 전개 거리에 대하여 일정하지 않다. 전개되며 이동하는 시료의 양도 달라지기도 하며 표면이 완벽하게 균일하지 않는 등 여러 이유가 있기 때문이다. 그래서 TLC 결과 분석에서는 억제 인자 Rf를 이용해서 분석하고자 하는 시료의 극성을 분석한다. 억제 인자는 동일 온도 하에 전개제의 상태가 균일하고 흡착제(얇은 판)의 두께가 일정하며, 분석시료의 양이 동일하면 반복된 실험에도 같은 값을 갖는다 전개 시작 지점으로부터 이동한 이동상(전개제)의 거리를 dM, 시작 지점에서 이동한 용질의 중심까지의 거리를 dR이라고 하자. 이를 이용하면 Rf값을 다음과 같이 정의할 수 있다.

\[R_f=\frac{d_R}{d_M}\]

TLC 크로마토그래피에서 사용하는 판은 실리카겔 등 얇게 코팅되어 있으므로 표면은 극성을 보인다. 만약 억제 인자 값이 크다면 표면에 대한 용해도가 낮아 전개제를 따라 많이 이동할 수 있는 것이므로 극성이 작은 것을 의미한다. 반면 극성이 큰 물질에 대해서는 억제 인자 값이 작게 나올 것이다. 왜냐하면 극성 표면에 의해서 전개제가 이동하는 것만큼 시료가 분자간 인력 때문에 쉽게 나아가지 못하기 때문이다. TLC의 결과를 유의미하게 얻기 위해서는 적당한 전개제를 제조하는 것이 중요하다. 각 실험에 대한 최적의 전개제는 실험에 의한 결과 비교로 정할 수 있다. 우선 용매강도에 대해서 고려해야 한다. 용매강도는 고정상에 대해 용매(전개제)가 얼마나 상호작용하는가를 의미한다. 정상 TLC에 대해서 실리카겔로 코팅된 표면에 의해 극성인 물질이 더 강한 용매강도를 보인다. 사용하는 용매의 부피 비율을 Fn, 각각의 용매 강도 인자를 Sn이라고 했을 때, 전체 용매 강도는 다음과 같이 얻을 수 있다.

\[S=F_1 S_1+F_2 S_2+\cdots \]

하지만 용매강도가 너무 크다면 고정상과 결합하고자 하는 경향이 커 효과적인 분리가 일어나지 않는다. 하지만 용매강도가 너무 작다면 고정상에 대한 흡착력이 지나치게 작아 용매가 얇은 판을 타고 올라가지 못해 분리를 못한다. 이 때문에 고정상에 대해 큰 용매강도와 작은 용매강도를 갖는 용매를 적절히 섞어 효과적으로 분리할 수 있는 전개제를 얻을 수 있다. 한편 시료가 각 성분으로 분리될 때 전개제를 타고 분리된다. 이때 ‘꼬리 끌림’현상이 발생할 수 있다. 만약 꼬리 끌림 현상이 발생한다면 정확한 전개 거리를 측정할 수 없으므로 약간의 아세트산이나 수용성 암모니아를 가해서 이 현상이 발생하는 것을 방지한다. 실제로 이번실험에서 사용하는 전개제도 용매 강도가 낮은 Butanol과 강도가 큰 정제된 증류수, 그리고 꼬리 끌림 현상을 방지하기 위한 아세트산을 적절한 비율로 섞어서 사용한다. 다만, 전개제를 만들 때는 정제된 증류수를 사용하는 것이 보다 올바른 수치를 얻게 도움을 준다. 왜냐하면 일반 수돗물을 사용할 경우 소독하기 위해서 사용한 약품들이 극성여부를 포함하여 전개제에 어떠한 영향을 주는지 예측할 수 없기 때문이다.

 

Ⅳ. Chemicals & Apparatus

1. Chemicals

물질 이름	화학식	화학식량(g/mol)	밀도(g/mL)	녹는점(℃)	끓는점(℃)
Methanol	CH3OH	32.04	0.792	- 97.6	64.7
Acetic acid	CH3COOH	60.05	1.049	16.2	117.5
1-Butanol	CH3(CH2)3OH	74.12	0.81	- 89.8	117.7
Silica gel	SiO2	60.08	2.65	1710	2230

적색색소, 청색색소, 황색색소, de-ionized water(D.I.W)(초순수)

2. Apparatus

TLC Plate, 10mL 주사기, 10mL 메스실린더, 모세관, 500mL 비커, 100mL 삼각 플라스크, Pasteur pipette, 저울, 솜, Spatula, 시계접시

 

Ⅴ. Procedure

실험 1. TLC판에 의한 색소의 분리

1. TLC 판 아래 (일자로 반듯한 부분)에서 1.0cm 간격을 연필로 밑줄 긋고, 약 1cm 간격으로 5개의 점을 찍는다.

2. 적색색소, 청색색소, 황색색소, 미지시료A, 미지시료B를 모세관에 묻혀서 점 찍은 곳에 찍는다.

3. 전개재 (Butanol : Acetic acid : D.I.W = 60 : 15 : 25)를 500mL 비커에 약 0.5cm 정도 (TLC의 점이 잠기지 않을 정도)로 붓고, TLC 판의 색소가 퍼지지 않도록 조심스럽게 넣은 후, 시계접시로 덮어준다.

4. 약 1시간 후 TLC 판을 꺼내고 전개제가 이동한 거리를 연필로 표시 후 말리고, 각 색소가 이동한 거리를 표시 후, Rf값 측정 값을 계산하고 사진 촬영을 한다. (소수점 아래 두자리까지)

 

실험 2. 컬럼 크로마토그래피를 이용한 색소 분리

1. 10mL 주사기에 솜을 얇게 깔아주고, Silica gel을 주사위 눈금 7mL까지 넣어준다.

2. 주사기 12mL 눈금까지 Butanol을 넣고 Silica gel이 완전히 적셔질 때까지 기다린 후, 100mL 삼각 플라스크를 주사기 아래에 받치고, 피스톤을 조금만 밀어 넣어 압력을 가하며 Butanol을 흘려서 보낸다.

3. Butanol이 충진제 가장 윗부분을 여유 있게 적셔줄 정도까지 확인하며 흘려서 보낸다. (주의: 피스톤 검정부분만 조금만 넣었다 뺐다를 반복하여, Silica gel 사이에 기포가 생기지 않도록 한다. Butanol을 충진제 눈금에 정확히 맞추어 흘려보내면 Silica gel이 마르므로 주의한다.)

4. 미지시료 A를 충진제 윗부분을 모두 덮을 정도로 넣어준다.

5. 피스톤으로 살짝 눌러 미지시료를 충진제의 적셔준 후, Butanol을 주사기 눈금 10mL 정도까지 채우고 피스톤을 5분 간격으로 아주 조금씩 눌러준다.

6. 용리액(Butanol)을 서서히 흘려주면서 색소가 분리되는 것을 관찰하고, 사진촬영을 한다.

7. 미지시료 B를 1)~6) 과정을 거쳐 분리하고, 사진촬영을 한다.

 

Ⅵ. Data & Result

실험 1. TLC에 의한 색소 이동거리와 Rf 값

	이동 거리	전개제 이동 거리	Rf
적색 색소	1.40	4.10	0.34
황색 색소	0.30		7.3×10-2
청색 색소	0.98		0.24
미지시료 A	청색: 0.84 황색: 0.07		청색: 0.21 황색: 1.8×10-2
미지시료 B	적색: 1.21 청색: 0.88		적색: 0.29 청색: 0.22

*이동거리 값 소수점 아래 둘째자리

1. 세 가지 색소의 극성 크기 순서

1) 황색  2) 청색  3) 적색

실험 2. 컬럼 크로마토그래피에 의한 분리 결과와 극성 비교

1. 미지시료 A 용출 순서

1) 황색  2) 녹색(청색)

2. 미지시료 B 용출 순서

1) 적색  2) 청색

3. 세 가지 색소의 극성 크기 순서

1) 청색  2) 황색  3) 적색

실제: 1) 황색 2) 청색 3) 적색

Ⅶ. Discussion

1. 실험 관찰 결과

1) TLC(실험 1)에 대한 관찰 결과

전개를 진행하기 전에 적색, 황색, 청색을 사용했고 미지 시료 A, B의 색은 각각 녹색과 남색계열인 것을 관찰할 수 있었다. 첫 시도에서는 Butanol만 전개제로 사용했다. 하지만, 적색 색소를 제외한 모든 색소들이 전개가 전혀 되지 않았으며 적색의 전개조차도 매우 미비했다. 이는 시료들도 어느정도 극성을 가지고 있는데, 뷰탄올이 약간의 극성 원자단을 포함하고 있긴 하지만, 그 정도가 미미하여 용질을 충분히 용해하지 못했기 때문에 시료가 거의 고정상에만 머무른 것으로 예상된다. 용매강도의 관점으로 보자면 용매 강도가 너무 낮아 용매가 고정상을 벗어나지 못한 것으로도 생각할 수 있다. 보다 빠른 전개를 위해서 물과 뷰탄올, 그리고 아세트산을 일정 비율로 섞은 전개제를 사용했다. 용매 강도가 조절된 전개제를 사용하니 황색 색소를 제외하고는 전개가 진행되었다. 전개된 시료의 형상을 보니 시료가 지면에 대해 수직으로 올라가지 못했다. TLC plate의 세로축에대하여 눈에 보일 정도의 경사도를 가지고 전개가 된 것을 확인할 수 있었다.  또한 아세트 산을 사용했음에도 불구하고 꼬리 끌림 현상이 발생해서 정확한 전개 거리를 측정하기는 어려웠다. 결과상의 불완전함을 감안하여 중심점들에 대해 길이를 측정한 후 이동 거리를 구했다. 각 시료의 이동거리와 전개제의 이동거리를 고려하여 억제 인자 Rf의 값을 구할 수 있었다. TLC plate의 표면에는 극성 물질인 실리카 겔이 얇게 도포되어 있기 때문에, 더 작은 극성을 띠는 색소들이 더 높이 올라갈 수 있다. 따라서 Rf값이 가장 큰 적색 색소가 가장 극성의 크기가 작으며 그 다음으로는 청색이 그리고 황색 색소의 극성 크기가 가장 큰 것을 알 수 있었다. 또한 미지시료 A에서는 황색과 청색이 분리되었으며, 미지시료 B에서는 청색과 적색이 분리된 것을 관찰할 수 있었다. 그리고 미지시료를 구성하는 각 색소의 이동 거리는 단일한 색소가 이동한 거리의 경향과 같았으며 이동한 거리는 더 짧은 것을 확인할 수 있다. 이는 각 시료가 혼합될 때 분자간 인력이 작용하여 발생한 결과라고 예상된다.

2) 컬럼 크로마토그래피(실험 2)에 대한 관찰

정상 크로마토그래피를 진행하기 위해서 극성 물질인 실리카 겔을 고정상으로 하고 이동상으로 작은 극성을 갖는 뷰탄올을 전개제로 사용했다. 이 기법에서는 고정상이 항상 균일한 상태를 유지하는 것이 중요하다. 실리카 겔 사이에 공기가 들어가서 분리를 방해해서도 안되며, 실리카겔이 균일하게 녹지 않아서 분리의 정도에 차이가 발생해도 안되기 때문이다. 실리카겔의 균일함을 유지하기 위해서 실리카겔을 적실 때 2가지 점을 고려했다. 우선 실리카 겔에 뷰탄올(전개제)를 밀어 넣을 때 주사기의 피스톤을 최대한 조금 넣으려고 했다. 뷰탄올로 실리카 겔을 적시기 위해서 지나치게 피스톤을 깊게 집어넣으면 그만큼 피스톤을 빼내야 하는 거리도 증가한다. 피스톤을 뺄 때 주사기의 구멍을 통해서 공기가 유입되며 이는 실리카겔 사이에 공기가 들어가는 결과로 이어진다. 결국 뷰탄올을 넣었지만 그 속에 공기도 같이 들어가게 되어 균일한 고정상을 유지할 수 없게 된다. 또한 실리카 겔이 건조되어 공기가 유입되는 것을 방지하기 위해 뷰탄올의 메니스커스가 실리카 겔의 최상단보다 항상 위에 위치하도록 뷰탄올을 충분히 사용했다. 시료가 최대한 수평을 이루며 분리될 수 있도록 시료를 같은 양으로 뷰탄올 전면에 시료를 부었다. 시료를 부어 실리카 겔에 충분히 흡수되도록 한 후 다시 뷰탄올(이동상)을 부어 미지 시료의 분리를 진행했다. 미지 시료 A의 경우 확실하게 분리가 되지 않은 듯해 보였으나 하단부가 노랑 빛을 보이며 상단부가 비교적 푸른 빛을 보이는 것을 통해 황색 시료가 먼저 용출되었으며 그 다음으로 청색 시료가 후에 분리되는 것을 확인했다. 또한, 미지시료 B에 대해서는 적색 시료가 먼저 용출 되었으며 청색 시료가 후에 용출되는 것을 확인할 수 있다. 정상 크로마토그래피에서 극성 고정상을 사용하므로 먼저 용출되는 색소가 비교적 더 작은 극성을 나타내는 것을 알 수 있다. 이를 이용하면 미지시료 A에서 황색 색소가 청색 색소보다 더 작은 극성을 보이는 것을 확인할 수 있으며, 미지시료 B에서는 적색 색소가 청색 색소보다 더 작은 극성을 나타내는 것을 알 수 있다. 이 두 정보를 종합하면 청색의 극성이 제일 크며 실험 2의 결과만으로는 적색과 황색 색소의 극성 크기는 불가능하다고 판단했다.

2. 실험 정보 종합 및 오류 발생 이유 확인과 개선

1) 실험 정보의 종합

실험 1과 실험 2의 정보를 통해서 미지시료에 대한 정보와 각 시료의 정보를 분석할 수 있었다. 미지시료가 어떤 색소로 구성되었는지 살펴보기에는 컬럼 크로마토그래피보다는 TLC를 이용했을 때 더 수월했다. 색의 삼원색은 마젠타(적색), 노랑(황색), 그리고 시안(청색)이 해당한다. 이를 기반으로 미지 시료의 색을 관찰해본 결과 초록(시안과 황색의 혼합), 남색계열(마젠타와 시안의 혼합)인 것을 알 수 있었다. 실제로 TLC를 진행해본 결과 미지시료 A가 황색과 청색, 그리고 미지시료 B가 청색과 적색 색소로 명확하게 구분되는 것을 통해서 미지시료 A의 조성은 황색과 청색 색소, 그리고 미지시료 B의 조성은 청색과 적색 색소인 것을 알 수 있었다. 시료의 조성은 큰 무리없이 분석할 수 있었지만, 각 시료가 갖는 극성의 크기를 비교할 때는 어려움이 존재했다. 두 실험결과와 실제 나왔어야 하는 결과가 어떤 차이점을 보이는지 밑의 표를 통해서 살펴보자.

	극성 크기 제일 큼	극성 크기 중간	극성 크기 제일 작음
이론적 수치	황색 색소	청색 색소	적색 색소
실험 1 (TLC)	황색 색소	청색 색소	적색 색소
실험 2 (컬럼 크로마토그래피)	청색 색소	황색 색소 또는 적색 색소

TLC에서 황색 색소가 거의 분리가 안되는 것처럼 보여 실험상 오류가 발생했다고 생각되었지만, 실제 결과와 상충되는 부분이 없었다. 오히려 컬럼 크로마토그래피를 진행했을 때 나타난 결과와 이론적으로 나왔어야 하는 결과가 상충하는 것을 확인할 수 있다.

2) 실험 결과에서 오류가 발생한 이유에 대한 고찰 및 보정

① TLC

ⅰ) 오차원인 분석

얇은 층 크로마토그래피를 진행할 때 크게 2가지 문제점이 있었기 때문에 올바른 실험 결과를 얻지 못했다 첫 번째로 제조한 전개제가 모든 시료를 분리하지 못했다. 뷰탄올과 물에 대해서 색소는 특별한 반응을 보이지 않으므로, 아마 아세트산의 작용으로 인하여 황색 색소가 이동하지 못했음을 생각해볼 수 있다. 또한 TLC plate의 가로 길이게 비커의 크기에 비해 약간 컸다. 그래서 TLC plate가 완전히 수평으로 있지 못하고 오른쪽으로 약간 기울었기 때문에 전개가 정확하게 발생하지 않았다.

ⅱ) 발생한 오류 값에 대한 보정

용매가 전개되는데 용질이 따라 올라가는 비율은 거의 일정하기 때문에 Rf값에 큰 영향을 미치지못한다. 지오지브라 프로그램을 이용해서 경사진 각도를 구하고 세로에 대한 정사영 값을 구해 Rf값을 구해도 수치의 변화도 거의 없으며 극성의 크기 변화에 영향을 주지 못함을 확인할 수 있다. 보정Rf는 가정된 수직 이동거리에 대해 값을 구하는 것이므로 다음과 같이 표현할 수 있다.

\[R_{f,fixed}=\frac{용매의\,이동거리\times cos(경사각)}{이동상의\,이동거리}=R_f \times cos(경사각)\]

변화 수치를 정확하게 보기 위해서 유효숫자를 무시하고 소수점 아래 넷째자리까지 표현했다.)

	경사각 ($\circ$)	실험 Rf	보정 Rf
적색 색소	5.34	0.34	0.3385
황색 색소	∙		∙
청색 색소	11.337	0.24	0.2353
미지시료 A	24.257	청색: 0.21 황색: 0.018	청색: 0.1914 황색: ∙
미지시료 B	27.257	적색: 0.29 청색: 0.22	적색: 0.2578 청색: 0.1955

또한 올바른 전개제를 사용해서 시료가 올바르게 분리되었다면 아래와 같은 결과를 얻을 수 있을 것이다.

② 컬럼 크로마토그래피

ⅰ) 오차원인 분석

미지시료 A에 들어있는 두 색소에 대해서 어떤 색소를 섞었는지 구분이 힘들었다. 이 때문에 미지 시료를 구성하고 있는 색소에 대해 극성의 차이를 명확하게 결정짓지 못했다. 실험을 진행할 때, 그리고 결과를 해석할 때 고려하지 않은 부분이 있었기에 잘못된 결과를 얻었다고 생각했다. 우선 실험 과정에서 발생한 문제점에 대해서 살펴보도록 하자. 분리를 위해 만든 칼럼의 길이에 비해서 분리하려고 했던 시료의 부피가 지나치게 컸기 때문에 실험 시간 동안 완전한 분리를 하지 못했다. 이번 실험을 하며 고정상(실리카 겔)이 마르지 않도록 뷰탄올의 메니스커스를 실리카 겔보다 높은 위치에 유지하도록 했어야 했다. 이 위에 미지시료를 넣을 때 뷰탄올과 실리카 겔이 충분히 실리카겔에 흡수된 후에 다시 뷰탄올을 부어야 한다. 이를 고려하지 않고 뷰탄올을 넣었기 때문에 뷰탄올에 시료가 섞여 분리해야 하는 미지시료의 부피가 증가했다. 결국 넣어준 시료의 양에 비해 분리해야 하는 시료의 양이 급증했기 때문에 분리를 위해 필요한 컬럼의 길이도 증가했으며 필요한 시간도 증가하게 되었다. 분리에 충분한 컬럼의 길이도 확보하지 못했고 또 완벽한 분리가 될 때까지 충분히 기다리지 않았기 때문에 명확한 분리 결과를 얻지 못했다. 두 번째로는 진행한 실험의 결과를 해석할 때의 다양한 변수를 생각하지 않고 보이는 결과만 이용해서 해석했기에 문제가 발생했다. 이번 실험 결과를 해석할 때 단순히 노란 계열 색이 컬럼의 하단부에 보였다는 것을 근거로 극성의 크기가 청색 색소가 더 크다고 판단했다. 하지만 ‘분리한 시료의 불균일성’에 대해서 고려하지 못했다. 진행을 분리한 시료는 황색 색소와 청색 색소로 이루어진 미지시료 A다. 이때 분리를 위해서 뷰탄올을 섞었기 때문에 분리가 된 시료가 완벽한 균일 혼합물이라고 판단하기 힘들다. 흙탕물과 같은 불균일 혼합물에서 같은 양의 모래를 섞었더라도 혼합물의 형상이 달라질 수 있다. 이번에 진행된 미지시료도 마찬가지이다. 시료가 전개제에 의해 불균일하다면 완벽한 분리가 발생했다고 판단하지 못한다면 그 시료가 눈에 보이는 것만으로는 어떤 상태에 놓여있는지 명확하게 규명할 수 없다. 이를 고려하지 않고 단순히 황색 색소가 밑에 있다는 관찰 사실만 가지고 실험을 다시 해보지 않고 결과를 확정했기 때문에 이상적으로 실험을 진행했을 때 얻을 수 있던 결과와 모순이 발생했다.

 

ⅱ) 발생한 오류 값에 대한 보정

이를 반영해서 올바르게 실험을 진행하면 아래와 같은 분리 형태 결과를 얻을 수 있다.

올바른 결과를 이용하면 실험 2만 진행했더라도 극성의 크기 비교를 할 수 있었을 것이다. 미지시료 A를 분리해본 결과 황색 색소의 극성이 청색 색소보다 더 큰 것을 알 수 있다. 또한 미지시료 B를 분리한 결과 청색 색소보다 적색 색소의 극성이 더 작은 것을 알 수 있다. 이 두 사실을 조합하면 극성의 크기를 큰 순서대로 나열하면 황색-청색-적색인 것을 확인할 수 있었을 것이다.

 

Ⅷ. Reference

1. 대한화학회, 표준 일반화학실험 제 7판, 천문각, 2011, pp. 73~82

2. 오도석, CHROMATOGRAPHY 1st reviced edition, 학술편수관, 2012. pp. 13~15, 82~83, 282~287

 

 

 

Ⅰ. Title

High Performance Liquid Chromatography (HPLC)

 

Ⅱ. Purpose

1. HPLC의 이론 및 기기조작을 통하여 혼합 액상의 성분을 분석한다.

2. 크로마토그래피의 원리와 물질의 몰흡광계수를 통해 시료의 정량, 정성 분석 방법을 익힌다.

 

Ⅲ. Theory

1. 크로마토그래피(chromatography)의 정의와 종류

크로마토그래피는 혼합물 중 유사한 성분들을 띠는 물질들을 분리할 수 있는 분리법이다. 이 분리법은 이동상-시료-정지상 사이의 상호작용을 이용해서 물질을 분리해낸다. 그래서 이동상을 기준으로 기체 크로마토그래피와 액체 크로마토그래피로 분류할 수 있다. 또한 정지상의 형태에 따라 column 크로마토그래피, 평면 크로마토그래피, 얇은 막 크로마토그래피로 분류할 수 있다. 뿐만 아니라 이동상-정지상 사이의 특이한 상호작용을 이용하는 친화성 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 그리고 크기 배제 크로마토그래피가 존재한다. 

 

2. 이동상(mobile phase)과 정지상(stationary phase)의 특성

1) 이동상과 정지상의 특성 - 정상 크로마토그래피와 역상 크로마토그래피

일반적으로 크로마토그래피는 이동상과 정지상, 그리고 시료 사이의 상호작용 정도로 혼합 시료를 각각의 성분으로 분리할 수 있다. 이동상 내의 시료와 정지상의 친화도가 강하다면 시료가 더 느리게 이동한다. 반면, 친화도가 낮다면 이동상을 따라서 빨리 이동할 수 있으며 이는 더 빠른 분류를 할 수 있다. 이처럼 물질 사이의 상호작용으로 시료의 이동 정도를 구분할 수 있다. 분자간 상호작용을 구분 짓는 큰 기준은 분자의 극성 여부이다. 이동상과 고정상 사이의 극성을 어떻게 설정하는 가에 따라 크로마토그래프는 2가지 종류로 구분되며, 이를 아래의 표로 정리하였다.

	정상 크로마토그래피	역상 크로마토그래피
고정상의 극성	높음	낮음
이동상의 극성	비교적 낮음	비교적 높음
시료성분 용출순서	무극성이 빨리 용출	극성이 빨리 용출
이동상의 극성과 용출속도의 관계	용출 속도가 느려짐	용출되는 속도가 빨라짐

표  SEQ 표 \* ARABIC 1 정상 크로마토그래피와 역상 크로마토그래피의 비교

2) 이동상의 이동방법

column을 이용하는 크로마토그래피의 경우, 시료를 위에 넣어 아래에서 시료를 분리하는 형태를 취하는 경우가 많다. 이 과정에서는 중력을 drive force로 하여 분리가 진행될 수 있으나, 더 높은 효율 원하면 압력 차이를 이용할 수 있다. 대표적인 예시로는 이번 실험에서 사용하는 HPLC 기법이 압력을 이용하여 크로마토그래피를 이용할 수 있다. 이는 drive force 세기의 차이로만 설명할 수 있으며, 실제로 보이는 이동상의 이동 방법의 원리는 2가지 정도가 있다.

① 등용매용리(Isocratic Elution)

isocratic elution은 시간의 흐름에 따라 이동상의 조성이 일정한 이동상의 흐름을 의미한다. 그러므로 column 내에서 이동하는 시료의 이동속도는 시간이 지나도 고유한 값을 갖는다. 즉, 혼합물 시료 중 각 성분의 극성 등 특성에 따라 다른 이동 속도를 보여줄 수 있으나 그 속도는 시간에 대한 등속도 운동을 보이는 것을 의미한다. 또한 column에 가해지는 압력도 서로 일정하게 설정하는 경우가 많다. 다만 분리하고자 하는 혼합물의 polarity 범위가 넓다면 친수성 물질의 경우 column retention이 좋지 않아 빠르게 용출이 될 수 있으며 소수성 물질의 경우에는 retention이 지나치게 발생하여 용출이 되지 않을 수 있다.

② 농도구배용리(Gradient Elution)

gradient elution은 시간의 흐름에 따라 이동상의 조성이 변하는데, 역상크로마토그래피에서는 용리 정도가 증가하도록 변한다. 이는 시간에 대해 이동상 중 유기 용매 비중이 증가하기 때문에 시료의 이동속도가 증가한다. 이와 같은 특성 때문에 resolution이 개선되고, separation efficiency가 증가하나, 이동상 조성이 변하기 때문에 상호 작용의 변화로 침전이 발생할 수 있다.

3) 이동상(용매)의 설정

이동상(용매)에 따른 분리의 특성이 변하므로, 특성을 고려하여 이동상(용매)을 결정하는 것은 중요하다. 이동상이 가져야 할 물리적 성질에는 검출이 용이해야 하며 점도 및 순도가 적당해서 이동이 잘 진행되어야 한다. 화학적 성질로는 이동상이 고정상을 녹이면 안되며, 시료 분자와 화학적 상호작용을 보이면 안된다. 또한 용매 세기를 잘 설정해야 한다. 설정한 용매가 complex일 때 용매의 부피 비율을 Fn, 각 성분의 고유한 용매 세기를 Sn이라고 할 때 전체 용매 세기를 얻을 수 있다.

다만, 용매 세기를 너무 높게 설정하면 고정상과의 상호작용이 크게 발생해 분리 자체가 발생하지 못하며, 너무 낮게 설정하면 고정상과의 상호작용이 거의 일어나지 않아 용매의 이동에 문제가 발생할 수 있다.

 

3. Chromatogram - 크로마토그래피 결과 분석

분석하고자 하는 크로마토그래피의 종류, 이동상/고정상 설정을 마친 후 실제로 분리를 진행하면 chromatogram을 얻을 수 있다. 크로마토그램을 이용하면 진행한 실험에 대해 몇 가지 정보를 얻을 수 있다. 이번 실험에서 사용하는 크로마토그래피는 액체크로마토그래피이므로 이를 기준으로 표현하겠다.

1) 용량인자, 크기인자 (Capacity factor k’)

용량인자는 이동상 및 시료가 고정상 (column)에 머무르는 정도를 표현한다. 이는 시료와 고정상이 얼마나 상호작용을 할 수 있는가를 표현하는 척도이다. 분리하고자 하는 시료의 성분이 column을 거쳐 분리된 상태로 용출되어야 하므로 서로 다른 용량인자 k’ 값을 보여야 한다. Capacity factor는 아래의 식과 같다.

 

Retention time은 시료마다 고유한 값을 갖는다. 또한 capacity factor의 값과 시료가 column에 머무르는 정도는 비례한다. 또한, capacity factor와 분리 정도는 비례하나, 그만큼 bandwidth W의 크기도 증가한다.

한편, Capacity factor는 column내에서 분배가 진행되는 과정 중 자유 에너지의 변화를 관찰할 수 있다. 이는 분배 계수(distribution coefficient)에 비례한다. 분배 계수는 이동상을 용매로 갖는 시료의 용해도에 대한 고정상을 용매로 갖는 시료의 용해도의 비 값을 말한다. capacity factor와 분배계수 사이의 관계를 수식으로 표현하면 다음과 같다.

이를 이용하면 capacity factor로 이동상 및 고정상에 들어있는 시료의 양을 표현할 수 있다. 이를 표현하면 다음과 같다.

k' 의 범위	시료 성분의 상대적인 농도
k'=0	시료가 고정상의 영향을 받지 않아 t0에 바로 시료가 용출이 됨
k'=1	시료가 2t0 지점에서 용출됨
1<k'<6	시료가 적당한 시점에서 용출됨

2) 선택성, 분리인자 (Separation or Selectivity factor, α)

selectivity factor는 분리하려고 하는 시료들에 대한 capacity factor의 비율이다. selectivity factor의 값이 1이면 두 시료가 분리되지 않음을 뜻하고, 1보다 클 때 두 혼합 시료가 분리되었다고 판단할 수 있다. α를 식으로 표현하면 다음과 같다.

3) 컬럼효율 (Column Efficiency)

column efficiency는 컬럼단이론(plate theory)를 이용해서 설명할 수 있다. 우선, 효율을 식으로 표현한 후 설명해보도록 하겠다. 여기서 N을 이론단수(Theoretical Plate Number)라고 하자.

N은 컬럼 효율의 척도를 표현하며, 주어진 실험 조건이 일정할 때 그 값은 거의 변하지 않는다. 해당 변수의 예시로는 이동상의 유속, 온도, 시료 주입의 조건 등이 있다. 컬럼효율은 시료가 컬럼을 통과하는 동안 발생하는 녹는 정도의 띠이며, 넓힘 현상의 정도를 말한다. 이는 이동상에 대한 분자들이 서로 다른 속도로 이동하며, 그 과정에서는 확산과 물질전달 등의 효과가 수반되기 때문에 관찰되는 현상이다.

한편, HETP는 Van Deemter Equation을 이용해서 표현할 수 있다. Van Deemter Equation은 다음 식을 따른다.

각 항이 갖는 의미에 대해 설명하며 HETP의 의미를 살펴보자.

 

A항은 소용돌이 확산(eddy diffusion) 효과를 표현한 식이다. (multiple paths term) 분자가 이동상을 따라 이동할 때 고정상과의 상호작용을 수반하는데, 이때 시료의 각각의 입자의 flow path는 달라진다. 이 경로의 차이는 시료들의 retention time에 영향을 미친다. 다만 이동상과 고정상을 그대로 유지하는 경우, 값은 일정하게 나타난다.

B항은 이동상에서 분자가 확산되는 정도를 의미하며, 이는 peak의 height가 커지는 정도를 의미한다. 용질은 고농도 지역에서 저농도 지역으로 이동하므로 띠의 중심에서부터 띠의 가장자리로 확산된다. 유속이 빠르면 그 정도가 감소하므로 반비례 관계를 보인다. 마지막으로 C항은 mass transfer의 정도를 의미한다. 이는 시료가 이동상과 정지상 사이에서 이동할 수 있는 정도를 의미한다. 만약 flow rate가 빨라지면 이동상-고정상 사이에서 평형이 발생하지 않고 시료가 이동하기 때문에 peak의 너비 W가 증가한다.

위의 A, B, 그리고 C항을 고려하면 column의 효율을 증가할 수 있다. (분리능 R의 조정)

① column의 길이를 증가시킨다. (다만, 지나치게 용리가 되지 않도록 조심해야 한다.)

② 이론적 column층의 높이 HETP의 높이를 줄인다.

한편 이론단수 N의 값도 효율을 표현할 수 있는데, 이는 다음과 같은 변수들에 의해 조정될 수 있다.

① column을 채우고 있는 입자의 크기를 줄일수록 N은 증가한다.

② flow rate과 N은 반비례관계이다. 즉, flow rate가 감소할수록 N은 증가한다.

③ 이동상의 점도가 낮아질수록 N은 감소한다. (점도와 N은 비례관계)

④ 이동상의 온도가 높을수록 N은 증가한다. (온도와  반비례관계)

⑤ 용질의 크기가 증가하면 N의 크기는 감소한다. (크기와 N은 반비례관계)

4) 분리도 (Resolution R)

이 척도는 주입한 시료가 최종적으로 용출될 때 column에 의하여 각 성분이 어느 정도로 순수하게 분리가 되었는지를 보여주는 척도이다. 이는 앞의 capacity factor, selectivity, 이론단수를 이용해서 정의한다.

이 식을 통해서 혼합 시료 내에서 설계된 크로마토그래피에 대해 비슷한 성질을 갖는 성분들이 분리된 정도를 표현한다.

위의 그림은 분리도 값에 따른 chromatogram을 표현한 것이다. 유사한 성질을 띠는 두 성질이 완전히 분리되었다고 판단할 수 있는 지점은 R=1.5이상일 때로 생각한다.

 

4. HPLC의 구성

HPLC는 이동상을 액체로 갖는 크로마토그래피이며, 분리가 빠르게 진행되도록 높은 압력이 필요하기 때문에 High Performance 또는 High Pressure Liquid Chromatography라고 한다. HPLC 기기는 다음과 같은 구성을 갖는다.

* 실험에서 사용한 HPLC의 특성을 표현하기 위하여 매뉴얼의 내용을 편집없이 그대로 기술하였다.

1) 이동상 저장기

이번 실험에서 사용하는 HPLC 기기는 하나 또는 그 이상의 저장기를 갖고 있으며, 이는 유리 또는 스테인레스 스틸로 구성되어 있다. 이 저장기에는 용해된 기체(일반적으로 산소)를 제거하는 장치가 붙어있다. 이동상에 공기가 녹아 있으면 기포가 발생하여 유속이 변하고 검출기의 성능을 떨어뜨리므로 사전에 제거해야 한다.

2) 펌프 장치

HPLC 펌프 장치는 이동상을 일정하고 재현성 있게 컬럼에 공급해야 하며, 아래의 조건에 부합해야 한다.

① 6000psi 까지 압력 발생이 가능해야 한다.

② 0.1∼10mL 사이의 흐름속도를 조절할 수 있어야 한다.

③ 펌프에서 나오는 용매의 공급은 펄스가 없어야 한다.

④ 펌프 내의 부분 장치는 부식되거나 용매와의 화학적 상호 반응이 없어야 한다.

⑤ 유속의 속도 및 유속의 재현성은 0.5 % 이내를 유지하여야 한다.

3) 시료 주입 장치

일정한 용매의 흐름에 대한 영향을 최소화하며 일정한 양의 시료를 주입하는 장치이다 시료의 주입은 용리 띠 현상 때문에 가능한 적게 주입하는 것이 좋다. 따라서 시료의 주입 부피는 가능한 작은 것이 좋다.

4) 컬럼

컬럼은 정지상을 충전한 좋은 분리관을 말한다. 컬럼의 재질, 모양 및 서로 다른 두 컬럼 사이의 연결 등이 분리에 매우 큰 영향을 미친다. HPLC 컬럼은 일반적으로 높은 압력이 필요하므로 이 압력에 견딜 수 있어야 한다.

5) 검출기

이상적인 검출기는 다음 특성을 갖추어야 한다.

① 높은 감도와 모든 분석 물질에 대해서 같은 감응도를 가져야 한다.

② 넓은 범위에서 선형적인 감응을 나타내야 한다.

③ 온도나 이동상의 흐름에 영향을 받지 않아야 한다.

④ 짧은 시간에 감응해야 한다.

⑥ 이동상이 감응하지 않아야 한다.

⑦ 용리 띠의 넓힘 효과가 없어야 한다.

⑧ 용질을 파괴하지 말아야 한다.

⑨ 신뢰도가 높고 사용이 편해야 한다.

Ⅳ. Chemicals & Apparatus

1. Chemicals

1) 400ppm R, T, X (용매 Acetonitrile 10mL + 시료 4 μl)

2) benzene, toluene, xylene, 미지시료 1, 미지시료 2

 

2. Apparatus

- HPLC

 

Ⅴ. Procedure

1. 기기 실행 및 연결 준비

1) HPLC 기기의 기계를 열어서 사용할 column의 연결이 되어 있는지 확인한다. (사용하는 column : 4.6 × 150mm C185μm column)

2) 사용하려고 하는 이동상(ACN : DW = 6:4)이 A번에 연결이 되어 있는지 확인 하고, 이동상이 400mL 이상 남아있는지 확인한다.

3) HPLC 기기의 Vacuum degasser, Quaternary pump, Column compartment, UV/Vis detector의 네 칸의 기기의 전원을 모두 작동한다.

4) 컴퓨터의 전원을 켜고 바탕화면에 있는 autochro-3000 프로그램을 실행한다.

5) 왼쪽 상단에 있는 분석목록을 누른 후 사용자 로그인을 한다. (비밀번호 없이 로그인) - 프로그램을 보면 사용자 로그인이 되어 있지 않기 때문에 왼쪽 하단을 보면 제어목록이 비활성화 되어있는 상태임을 확인할 수 있다.

6) 왼쪽 하단의 제어목록이 활성화되면, 제어목록으로 창을 전환한 후, 왼쪽 상단의 제어목록을 누른 후, 제어목록 열기 버튼을 누르고, 제어목록을 실행한다. 이때, 왼쪽 중앙 제어목록들 하단에 이미 실행되고 있는 제어목록이 있으면 우클릭을 하여 제어목록을 닫는다. (바탕화면 HPLC 폴더에 9100 file)

7) 연결이 될 때까지 기다린 후, 각 기기별 상태가 빨간색으로 뜨면, 화면 중앙에 실행되고 있는 제어 목록을 누른 후, 제어 목록 다시 열기 버튼을 누른다. 기기별 상태가 검은색으로 뜨고, 제어목록들 하단에 기기들의 연결이 완료되면 참조광량과 샘플광량이 50 이상의 값에서 안정화가 될 때까지 기다린다. (기기 이름 오른쪽에 ~ : 연결 되는 중, *: 연결 오류) (50 이하로 떨어질 경우 lamp의 교체가 필요하다.)

8) 분석 분비 버튼을 누르고, 기기 이름 오른쪽에 ~ 표시가 사라진 것을 확인한다.

9) PUMP를 더블 클릭하여 pump 창을 활성화하고, PUMP를 우클릭해서 추적그래프를 연다.

10) 연결된 이동상이 A 100% B 0% C 0% D 0%로 되어있는지 확인한 한다. (A번에 제대로 연결이 되어있는 지 확인) 하단 유속값에 0.3mL/mim을 넣은 후 적용 버튼을 누르고 작동 버튼을 누른다. PUMP창 상단의 상태에 유속 값이 변하는 지 확인한다.  

11) 이동상이 흐르고 있는 관에 있는 기포를 제거하기 위해 프라임 단계를 진행한다. Quaternary pump(HPLC 기기의 두번째 칸)에 있는 valve를 왼쪽으로 끝까지 돌린 후, 압력이 0으로 떨어진 것을 확인 한 후에, PUMP 창에서 프라임 시작 버튼을 누른다. 프라임이 제대로 진행되고 있는지는 valve안에 있는 기포가 움직이는 것으로 확인할 수 있으며, 소리로도 확인할 수 있다.

12) 프라임을 30초 정도 진행한 후에 프라임 중지 버튼을 누르고, 왼쪽으로 끝까지 돌렸던 valve를 다시 오른쪽으로 끝까지 돌려서 잠근다.

13) 잠시 후 다시 압력이 올라가는 것을 확인하고, 추적그래프에서 압력이 stationary state이 되면, 압력을 0.8mL/mim으로 올린다.

14) 그 이후 0.2mL/mim의 압력을 더 올려 1.0mL/mim까지 올린다.

15) 유속이 1.0mL/mim인 상태에서 압력이 1500~2000psi 사이의 값에서 일정해지는지 확인한다. (유속 1.0mL/mim으로 올린 후, 8분 정도 유지해서 확인) 압력이 일정해지면 sample을 분석할 준비를 한다.

 

2. Sample 시료 분석 방법

1) 프로그램 창 중앙에 시료 목록에 기존에 사용되었던 시료목록이 기입되어있으면, 모두 삭제한다.

2) 시료 목록 창에 우클릭을 하여 시료 추가버튼을 누른다.

3) 시료 이름, 파일 이름, 시료 ID 값에는 분석하고자 하는 시료의 이름을 넣는다.

4) 제어방법버튼을 누르고, 찾기 버튼을 누른 다음 HPLC 폴더 안에 있는 ‘화공기초실험 HPLC 제어 min’을 모두 넣는다.

5) 분석목록 버튼을 누르고, 찾기 버튼을 누른 후, ‘화공기초실험 HPLC 7min’ 폴더를 열고 해당 그룹 폴더 안에 파일 이름을 넣고 열기 버튼을 누른다. 분석목록 파일 이름대로 새 파일이 생성된다.

6) 후처리 목록을 적분으로 설정한다.

7) Syringe에 시료를 넣고 (모든 시료는 30μL), syringe안에 기포가 없는지 확인해야 한다. 기포가 있으면 syringe 안의 시료를 버리고, 다시 syringe에 시료를 넣는다. (이때, syringe의 종류와 sample의 종류가 섞이지 않도록 주의한다.)

8) 기기 오른쪽 부분의 injection valve를 왼쪽 (load)로 돌린 후, syringe 바늘을 끝까지 넣은 후 injection한다. 그 후 valve를 오른쪽(inject)으로 돌리게 되면 분석이 시작된다.

9) 마찬가지로 모든 시료를 분석한다. (CAN, benzene, toluene, xylene, 미지시료1, 미지시료2)

 

3. 결과 분석 방법

1) 분석목록에 들어가서 분석하고자 하는 sample을 선택한다. (왼쪽 상단 분석목록 -> 열기 -> 파일) 또는 제어목록에서 이미 완료된 sample을 더블클릭한다.

2) Shift키를 누르고 peak 처음부터 끝까지 드래그 한 후 적분 초기화를 한다.

3) 원하는 peak를 shift키를 눌러서 드래그 한 후 강제 피크를 선택하여 면적을 구한다.

4. 종료 방법

1) 유속을 0mL/min으로 맞춘 후, 압력에 0psi에 도달하면 정지한 후, HPLC 프로그램을 끄고, 바탕화면 오른쪽 하단에서 usb를 제거하듯이, 프로그램 연결해제를 한 후에, HPLC 기기를 위에서부터 차례대로 종료한다.

2) 컴퓨터를 종료한다.

3) 흘러나온 이동상을 폐기물통에 버린다.

Ⅵ. Data & Result

 

2. 정량적 Data 분석

1) 정보정리

	머무름 시간 RT (min)	면적 (mV*sec)	면적비 (%)
Benzene (B)	4.0750	626.4771	100.00
Toluene (T)	5.7100	935.0903	100.00
Xylene (X)	*8.4233	775.9974	100.00

 

* Xylene의 RT는 가장 peak를 기준으로 고려했다. 구체적인 이유는 Discussion에서 다루겠다.

		머무름 시간 RT (min)	면적 (mV*sec)	면적비 (%)
미지시료1	**1st peak	4.0767	360.6497	52.44
	2nd peak	8.4250	327.1414	47.56
미지시료2	1st peak	4.0800	242.0078	38.14
	2nd peak	5.7150	392.5988	61.86

 

** RT를 고려하면 미지시료의 1st, 2nd peak를 표준시료의 혼합물로 생각할 수 있으며, 각 peak가 어떤 물질의 peak인지도 알 수 있다. 마찬가지로 구체적인 설명은 Discussion에서 다루겠다.

	1st peak	2nd peak
미지시료 1	B	X
미지시료 2	B	T

 

2) capacity factor k'  (용량인자)

'= t1R - t0 t0

- 이동상의 머무름 시간이 수치로 제시되지는 않았으나, geogbra로 좌표를 설정하여 내분 비율로 각 분석에 대한 t0 를 얻을 수 있다.    (t1R : 시료의 머무름 시간 t0 : 이동상의 머무름 시간)

	t0  (min)	t1R  (min)	'
B	1.0562	4.0750	2.8582
T	1.0883	5.7100	4.2467
X	1.0959	8.4233	6.6861
미지시료 1	1.0618	4.0767	2.8394
미지시료 2	1.1012	4.0800	2.7050

 

3) Selectivity factor α (선택성)

α= t2R - t0 t1R - t0= t2'Rt1'R= k2'Rk1'R

- B-T/T-X/X-T에 대한 α와 미지시료의 α를 얻을 수 있다.

	k2'R  (min)	k1'R  (min)	α
B-T	4.2467	2.8582	1.4858
T-X	6.6861	4.2467	1.5744
X-B	6.6861	2.8582	2.3393
미지시료 1 (B, X)	6.9346	2.8394	2.4423
미지시료 2 (B, T)	4.1898	2.7050	1.5489

 

3) 이론단수 N과 이론단 높이 H

- 이론단수는 실험 데이터에 제시되어 있으나 아래의식을 통해서 계산할 수 있다.

N=16tRWb2=5.54tRW1/22

Wb : peak 최하단 부분의 길이 W1/2 : Wb 의 절반

- 4.6 × 150mm C18 5μm column을 사용하므로 컬럼의 길이는 150mm로 두고 계산을 진행했다.

HETP (H)=LN

 

 

		이론단수 N	이론단 높이 H (mm)
B		6404.3	0.023422
T		8769.0	0.017106
X		8446.6	0.017758
미지시료1	1st peak	6850.1	0.021897
	2nd peak	8112.7	0.018490
미지시료2	1st peak	8618.3	0.017405
	2nd peak	10081.0	0.014880

 

4) Resolution R (분리도)

Rs=∆tW=2∆tWA+WB

- 혼합시료가 순수하게 분리된 정도를 분석하는 것이므로, 미지시료에 대해서만 분석하면 된다.

	WA  (sec)	WB  (sec)	∆t  (min)	Rs
미지시료 1	11.82	22.44	4.3483	15.23
미지시료 2	10.55	13.66	1.635	8.104

 

 

6) 미지시료 구성과 농도 구하기

- sample에 포함되어 있는 시료의 부피

30μL×4×10-64×10-6+10×10-3=0.011995⋯≈0.01200μL

- ‘미지시료에 포함되어 있는 부피 : 면적 = sample에 포함되어 있는 시료의 부피 : 면적’을 계산하여 미지시료에 포함되어 있는 B, T, X의 양을 결정짓는다.

- 시료의 양이 적으므로 아세트아마이드 : 증류수 = 6 : 4의 평균 밀도를 이용해서 각 시료의 질량비를 계산한다. (모두 약분되므로 부피비의 비율을 이용해도 무방하다.)

		부피 (μL)	질량비
미지시료 1	B	6.908×10-3	0.5773
	X	5.059×10-3	0.4227
미지시료 2	B	4.636×10-3	0.4792
	T	5.038×10-3	0.5208

Ⅶ. Discussion

1. RT 해석

RT는 크로마토그래피 중 처음으로 시료가 검출이 되는 데 걸리는 시간을 의미한다. 이는 RT를 알면 컬럼에서 시료가 이동하는 속도를 비교해볼 수 있다. 표 3에서 B, T, X순으로 RT가 더 빠른 것을 확인할 수 있다. B를 기준으로 T와 X는 각각 메틸기가 1개, 2개가 치환되어 있는 형태이므로 분자의 크기가 커질수록 이동상에서 시료가 더 움직이기 힘들다는 결과를 알 수 있다. 다만, 그림 9에서 X는 같은 물질임에도 불구하고 3개의 peak가 관찰된다. 이는 X가 T를 기준으로 메틸기가 붙은 자리에 따른 이성질체가 존재할 수 있기 때문이다.

각 peak와 xylene을 대응하려면 HPLC의 이동상과 고정상에 대해 살펴보아야 한다. HPLC는 무극성의 고정상을 사용하며, (물+아세트아마이드)인 극성인 이동상을 사용하기 때문에 역상크로마토그래피라고 할 수 있다. 그렇기에 극성이 큰 물질일수록 이동상과의 상호작용이 고정상보다 증가하기 때문에 빨리 검출된다. X의 이성질체 중 메틸기가 서로 대칭으로 있는 p-xylene이 가장 작은 극성을 가지며, o-xylene은 가장 큰 극성을 갖는다. 따라서 그림 9에서 보이는 3개의 peak는 빨리 검출되는 순서대로 p-xylene, m-xylene, o-xylene이며, RT는 o-xylene을 기준으로 측정한 것임을 확인할 수 있다. 한편 B, T, X의 검출속도와 X의 이성질체의 검출 속도를 통해서 분자의 크기와 극성여부가 검출 속도에 영향을 주는 정도를 비교할 수 있다. 극성은 B, T, X순서로 증가하는데, 분자의 크기도 같은 순서대로 증가한다. 하지만 가장 무극성을 띠며 크기가 작은 B가 제일 빨리 검출이 되는 것으로부터 분자의 크기가 분자내 극성여부보다 더 주요한 영향을 미치는 것을 알 수 있다.

한편, RT의 상대적인 비교로 미지시료를 구성하고 있는 표준 시료들을 결정해야 미지시료가 포함하고 있는 물질의 조성을 구할 수 있다. 미지시료가 표준시료들의 혼합물이라는 것을 생각했을 때 mixture이기 때문에 상호작용을 감안하더라도 RT의 값이 비슷하게나마 관측이 되어야 하며 비교 결과 미지시료 1은 B, X 미지시료 2는 B, T로 구성되어 있는 것을 알 수 있었다. 그리고 peak의 면적 사이의 비율을 이용하면 실제 포함되어 있는 시료들의 부피를 구할 수 있다. 면적을 구성하는 정보는 시간과 전위차다. 같은 물질에 대해서 발견되는 전위차는 거의 유사할 것이므로 peak의 길이가 물질의 양을 결정지을 수 있다. 이에 실험에서 사용한 sample의 부피와 이동상과 표준시료 사이의 부피비를 고려하여 표준 시료의 부피와 그에 따라 관측되는 면적의 비를 구해서 물질의 양을 결정지었다. 부피는 온도, 압력 등에 의해서 영향을 많이 받기에 이를 solvent dry basis를 기준으로 미지시료의 질량 조성을 표현할 수 있었다.

2) 용량인자 분석

용량인자는 분석 sample이 구성하고 있는 각 성분이 column에서 머무는 정도를 표현한 것이다. 표 6에 해당 결과를 정리했으며 B, T, X 순서대로 용량인자가 증가하는 것을 확인할 수 있다, 이는 RT에서 설명했던 것과 같이 분자의 크기가 증가할수록 이동하는 정도가 감소하여 column에 더 오래 머무를 수 있기 때문이다. 용량인자는 peak의 위치 뿐만 아니라 실제 정량적인 계산을 통해서 구할 수 있다. 이는 이동상이 이동하여 peak가 관찰되는 시간과 그 후로 시료가 검출되기까지 걸린 시간의 비율을 구하면 된다. 제공받은 자료에서는 시료에 대한 시간만 나와있어서 이동상의 peak가 나타나기까지 걸린 시간을 따로 구할 필요가 있었다. 제공받은 그림을 geogbra에 옮겨 시작점, 이동상 검출 시점, 시료 검출 시점 사이의 비율을 구한 후 시작점과 시료 검출 시점에 대해 비율을 갖는 이동상의 검출 시점을 구할 수 있었다. 이론상으로는 같은 실험 환경에서는 이동상의 검출 시간은 동일해야 한다. 하지만, 실제 구해본 결과 이동상의 검출 시간에는 약간의 오차가 있었다. 이는 순수한 이동상이 이동하는 것이 아는 혼합물이 column을 따라 이동하기 때문이다. 그리고 기기가 실험 환경을 잘 조성했을 것이지만, 약간의 설정 오차가 발생하여 검출 시 차이가 발생했을 수 있다. 그리고 용량인자의 값을 통해서 용출의 적합성을 판단할 수 있다. 표 6을 확인해보면, 용량인자 중 가장 작음 값이 2.7050으로 이 수치는 1보다 크다. 그러므로 모든 시료가 적절하게 용출이 되었다고 판단할 수 있었다.

3) 선택성 분석

선택성은 mixture인 경우 peak가 얼마나 잘 분리되었는가를 비교하는 것이다. 이는 두개 이상의 peak가 갖는 용량인자의 비율을 계산해서 얻을 수 있다. 이번 실험에서 살펴봐야 할 mixture은 미지시료와 표준시료 중 X이다. 우선, 미지시료를 판단하기 위하여 표준시료 사이의 선택성과 실제 미지시료 사이의 선택성을 구하고 이를 표 7에 정리했다. 이상적인 mixture이라면 표준 시료 사이의 비율과 실제 미지시료의 비율은 동일해야 한다. 하지만 실제 측정 결과 그렇지 못했다. (애초에 표준 시료에 대한 정보들의 측정이 정확하지 못할 수 있지만 해당 가능성을 배제하고 설명하겠다.) 해당 현상을 설명할 수 있는 것은 사용한 sample이 실제로는 ideal solution이 아니라는 것이다. B, T, X 모두 탄화수소이므로 무극성 전자구름을 갖는 영역이 존재하여 시료 사이의 상호작용이 존재한다. 이는 표준 시료만 있을 때와 달리 상호작용으로 용출 시간이 영향을 받을 수 있다. 부수적인 이유로는 크로마토그래피 running 환경에 약간씩 차이가 났다는 점을 들어볼 수 있다. 그리고 X의 peak에 대해 살펴보자. 실제 선택성을 계산을 하지는 않았으나 그림 9를 보면 비교적 peak가 겹쳐져서 나타나는 것을 확인할 수 있다. 이는 이성질체가 서로 상호작용을 통해서 하나의 X 처럼 거동을 했기 때문이다. 정제 방법 등을 사용해서 한 가지 X를 사용하거나 분리도를 더 좋게 실험 환경을 설정하면 보다 나은 실험 결과를 얻을 수 있을 것이다.

4) 이론 단수 (N)와 이론단 높이 (H) 분석 + 더 높은 효율의 크로마토그래피 running 방법

이론 단수와 이론단 높이는 컬럼의 효율을 보여주는 대표적인 지표이다. 이론단수와 이론단높이는 식을 통해서 계산할 수도 있으나 실험 결과에 해당 지표가 표현되어 있었기 때문에 이론 단수는 직접 계산하지 않았다. 그리고 기기의 정보를 통해 사용한 column의 길이를 이용해서 H를 계산할 수 있었다. 이동상의 유속, 온도, 시료 주입 조건 등 실험 환경이 동일하다면 해당 값은 거의 변하지 않아야 한다. 표 8에 정리된 정보를 보면, 표준 시료 형태일 때의 N과 미지시료를 구성하는 각 성분일 때의 N이 차이를 보이는 것을 확인할 수 있다. 해당 원인을 Van Deemter Equation을 통해서 살펴보자.

HETP=A+B/μ+Cμ

이동상의 속도 μ 가 일정하다고 했을 때 소용돌이 확산 정도 A, 이동상에 시료가 확산되는 정도 B, 물질 전달 정도 C를 통해서 생각해볼 수 있다. 우선 같은 이동상과 고정상을 사용하므로 A에 대한 차이는 거의 발생하지 못한다. B는 peak의 높이를 나타내는데, 해당 결과 데이터를 보면 표준 시료들과 미지시료에서의 height에서는 거의 차이가 발생하지 않음을 확인할 수 있다. 즉 미지시료에서 C의 차이가 발생했기 때문에 값의 차이가 발생했다고 할 수 있다. C는 시료가 이동상 - 정지상 사이에서 이동할 수 있는 정도를 뜻하는데, mixture인 경우 해당 상호작용에 영향을 받을 수 밖에 없다. 다만 실험을 1번만 진행했기 때문에 N의 증감 경향성이 들쑥날쑥하며, 정확한 경향성은 확인할 수 없었다.

한편, N의 값을 조정함으로써 column의 효율을 증가시킬 수 있다. 첫 번째로 column의 길이를 증가시켜서 시료 사이의 분리가 더 잘 진행되도록 한다. 하지만 column의 길이를 가하는 압력, 이동상의 속도가 수용하지 못할 정도로 증가시킨다면 이동상에 시료가 필연적으로 혼합되기 되기 때문에 pure한 이동상을 사용하지 못하게 되며 되려 분리 효율을 떨어트릴 수 있다. (mixture의 entropy에 대해서 두 물질의 극성이 다르더라도 소량에 대해서는 무조건 혼합이 가능하기 때문이다.) 그리고 column을 채우고 있는 입자의 크기를 줄여서 더 균일하고 표면적이 증가한 상황에서 running을 진행하면 효율이 증가한다. 또한 이동상의 온도를 높이고, 점도를 낮추어서 효율을 높일 수 있다. 그리고 기기상의 문제가 아닌 실험자가 지나치게 크거나 분자구조가 긴 sample을 running하지 않아 자체적으로 더 높은 분리 효율을 얻을 수 있다. 그리고 시료를 넣을 때 공기가 유입되지 않도록 해야 한다. 이는 같이 주입된 공기에 포함되어 있는 물질 등이 농도에 영향을 줄 수 있으며 심지어 불필요한 peak를 얻어내는 데에도 영향을 주기 때문이다. 그리고 running 도중 압력을 일정하게 유지시켜 마찬가지로 압력차에 의해서 발생하는 불필요한 peak가 발생하지 않도록 조정할 수 있다.

5) 분리도 분석

결국 크로마토그래피는 미지 시료를 분석하고 정량적 수치를 얻어내고자 하는 정제과정이기 때문에 효율은 혼합물들을 잘 분리하는 지표를 나타내는 분리도와 직결된다. 분리도는 앞서 구한 용량인자. 선택성, 이론단수를 이용해서 구할 수 있으나. mixture에 대해서 해당 수치들의 기준을 잡는 것이 애매하다. 이에 혼합물을 구성하고 있는 peak 너비의 평균과 구성하고 있는 시료들이 각각 분리될 때 까지 걸리는 시간 사이의 비율을 이용해서 분리도를 구할 수 있다. 그림 6에서 분리도의 수치에 따른 peak의 분리 정도를 확인할 수 있다. 이번 실험 결과 미지시료 1과 2의 분리도는 각각 8, 12이상이므로 분리가 잘 되었다고 판단하는 기준값인 1.5보다 매우 큰 것을 확인할 수 있다. 즉, 분리가 잘 되었다는 것으로 판단이 가능하다. 하지만 표준시료 X의 분석 결과를 보면 peak가 완전히 분리되지 못한 것을 확인할 수 있다. 만약 해당 peak들에 대해서 분리도를 계산하면 1.5보다는 작은 값들을 얻을 수 있다고 예상 가능하다.  

Ⅶ. Reference

1. 서강대학교 화공생명공학기초실험1 매뉴얼 2020

2. 오도석, CHROMATOGRAPHY 1st reviced edition, 학술편수관, 2012. pp. 13~15, 82~85