전기영동 실험 결과 해석

 

 

 

 

1. Introduction

이번 실험에서는 다양한 종류의 전기영동 방법 중 gel을 쉽게 만들 수 있는 Agarose gel 전기 영동을 이용해서 주어진 Sample DNA를 분리하도록 했다. 우선 전기영동에서 고정상으로 사용할 gel을 합성하려고 Agarose와 1x TAE buffer 25mL를 혼합했다. 이동상으로도 같은 buffer를 사용하는데, 적당히 pH를 조절해서 DNA가 해리되는 것을 방지하며, Tris base로 DNA가 이동할 수 있는 양이온이 제공되며, EDTA로 금속이온을 제거해서 DNA가 손상되는 것을 막을 수 있기 때문이다. TBE buffer으로도 gel을 합성할 수는 있었지만 분해능이 TAE보다 약하므로, 이동상과의 화학적 성질의 차이를 최소화하기 위해서 TAE buffer를 용매로 사용했다. Agarose를 모두 녹이기 위해서 전자레인지를 사용했다. 전자레인지를 사용하게 되면 고립된 공간에서 빠르게 열을 발생시키기 때문에 Agarose를 빠르게 용해할 수 있으나, 갑작스럽게 끓어오르는 것을 방지하기 위하여 랩을 씌운 후 구멍을 조금 뚫어서 빠른 용해와 끓어오름을 방지했다. DNA의 전개 정도를 뚜렷하게 관찰하기 위해서 이번 실험에서는 UV-trans illuminator을 사용한다. EtBr은 뉴클레오타이드 사이의 수소결합에 관여하여 형광정도를 크게 증가하도록 할 수 있다. 이 물질을 gel을 합성할 때 같이 섞어주면 DNA가 전기영동 시 이동하면서 gel에 들어있는 EtBr과 반응할 수 있기 때문에 gel에 섞어주곤 한다. 하지만, 이 물질은 독성이 있으며 DNA의 이동에 영향을 줄 수 있으므로 대체 물질인 RedSafe를 gel을 합성할 때 섞어주었다. 이를 넣기 위해서 micropipette을 사용하는데, 정확한 양을 옮기도록 했기 때문이며 소개된 사용 방법을 따라서 시약을 옮겨 넣었다. 용액을 굳혀 gel을 만들기 위해서 Gel casting plate에 기포가 생기지 않도록 gel을 부었다. 그리고 gel을 넣을 때 tray와 gel casting plate 사이에 공간이 발생하여 합성 중 기포가 발생해 gel에 섞여 들어갈 수 있으므로 이를 방지하기 위해서 둘을 밀착시켜 남은 기포를 제거했다. 그리고 불순물과 같은 먼지를 tip을 이용해서 제거해서 최대한 순수한 gel로 굳히고자 했다. 후에 Loading시 시료를 넣을 자리를 만들기 위해서 Comb를 꽂은 후 gel을 식혀 굳혔다. gel이 완성되면 전기영동을 진행하기 위해서 gel box에 넣는다. 이때 DNA가 전기적으로 음성임을 고려해서 well을 음극을 향하게 배치하여 전기영동시 DNA가 이동거리를 충분히 확보할 수 있도록 했다. 실제로 전기영동을 진행할 DNA는 너무 가볍기 때문에 그냥 well에 집어넣으면 buffer에 흘러나갈 수 있기 때문에 이를 방지하기 위해서 loading dye를 섞어준다. 다만 또 너무 무거운 물질이 포함된 dye는 전기 영동을 방해하기 때문에 큰 영향을 주지 않는 정도의 dye를 사용해야 한다. 그리고 dye를 이용해서 UV-trans illuminator을 사용하지 않고도 어느정도 전기 영동이 진행되었는지 판단하기 위해서 사용하기도 한다. e-tube에 sample과 loading dye를 섞기 위해서 tapping과정이 필요하며, 시료의 양이 매우 적으므로 약하게 혼합을 진행해야 한다. well이 찢어져서 gel을 다시 만들지 않도록 조심해서 well에 시료와, 전개된 정도에 따른 비교 및 DNA의 종류를 결정짓기 위해서 100bp plus ladder를 대조군으로 넣었다. 적당한 시간이 지난 후 실험 결과를 확인하기 위해서 UV-trans illuminator에 gel을 옮겼다. 이때 기포가 생기도록 gel을 놓으면 산란 현상 때문에 뚜렷한 결과를 확인하기 힘들기 때문에 이를 감안하여 기포가 생기지 않도록 조심하게 내려놓았다.

 

2. Chemicals & Apparatus

1) Chemicals

1x TAE buffer, 6x loading dye, DNA ladder, Agarose, DW(증류수), RedSafe

* nx 용액: 실험에서 사용하는 농도보다 n배 진한 용액

 

2) Apparatus

Gel box, Gel casting tray, Microwave, UV-trasn-illuminator, Erlenmeyer flask, Micropipette E-tube

 

3. Procedure

실험 1 Agarose Gel 만들기

1) 두 조당 하나의 gel을 사용한다.

2) Gel casting tray와 comb, 플라스크를 깨끗이 씻는다.

3) Agarose 0.25g과 1x TAE buffer 25mL를 100mL삼각 플라스크에 넣고 랩으로 막은 후 tip으로 구멍을 여러 개 뚫는다.

4) 45초 정도 데운 후 얼마나 녹았는지 확인한다. 이후 15~30초씩 데우면서 agarose가 완전히 녹을 때까지 데운다. 꺼내어 흔들었을 때 투명하고 작은 알갱이들도 다 녹여야 한다. 필요 이상으로 오래 데워서 물이 증발하면 농도가 진해져 영동 속도가 느려 진다.

* 플라스크가 뜨거우므로 목장갑을 사용한다.

5) 혼합용액에 RedSafe 1.3μL를 넣어준다.

6) Gel틀에 기포가 생기지 않게 천천히 용액을 부은 후 노란 tip 뒷부분으로 tray를 누르고 일정한 방향으로 밀어서 밑의 공기를 뺀 후 떠있는 기포도 모두 제거한다.

7) Comb를 꽂은 후 20~30분 정도 굳힌다.

* 플라스크에 남은 용액이 굳으면 씻어내기 까다로우니 바로 세척할 것

 

실험 2 Agarose gel Electrophoresis

1) 굳힌 gel의 well이 망가지지 않도록 조심스럽게 comb를 뽑고 tray채로 gel box에 넣는다. 이때, well이 (- )극을 향하도록 한다.

2) Gel box에 Gel이 잠길 정도로 1x TAE Buffer를 넣는다. (Tray 기준 빨간 점선 사이까지만 채우면 충분하다.)   

3) 새 e-tube에 준비된 DNA sample 3μL과 6x Loading Dye 0.6μL를 넣는다.

4) DNA는 충격에 약하므로 tapping하여 섞는다.

5) Well에 100bp plus ladder 4μL, sample 3μL씩 load한다. 팁으로 gel을 찢거나 뚫지 않도록 주의한다.

6) 20~30분 동안 Ful Voltage로 Gel Run을 진행한다.

 

실험 3 UV-trans illuminator로 결과 확인하기

1) Ethanol로 illuminator 위를 깨끗이 닦는다.

2) Ethanol이 마르면 젤을 cast에서 조심스럽게 떼어 illuminator에 올려놓는다. 이때 gel 아래에 공기가 들어가면 적당히 움직이거나 눌러 공기를 뺀다.

3) 덮개를 덮고 불을 끈 후 illuminator를 켜서 관찰한다.

 

4. Data & Result

 

5. Discussion

전기영동 실험의 결과는 크게 2가지로 해석할 수 있다. 첫 번째는 sample DNA가 이동하여 형성된 bend의 선명도 및 진행 경로 등을 보는 것이다. 그리고 두 번째는 각 시료와 ladder가 얼마나 진행하여 분리하고자 했던 시료가 어떤 물질에 해당하는 지 비교하는 것이다. 첫 번째 관점에서 실험 결과를 살펴보자. 그림 9에서 ladder와 sample A와 B 모두 형광색이 명확하게 발현되었음을 확인할 수 있다. 이를 통해서 전기 영동 장치에 전압이 적절히 걸려 있고, 첨가한 샘플의 양이 적절했으며, 실험과정 중 well이 잘 형성되었음을 알 수 있다. 두 번째 관점에서 실험 결과를 살펴보도록 하자. 원래는 ladder이 분리된 것을 기준으로 각 시료가 이동한 정도를 비교해서 사용한 시료 당 포함된 DNA의 질량 및 그 DNA의 염기쌍 포함 정도를 알 수 있다. 이번에 사용한 gel이 정확히 1.5% TAE Buffer Agarose gel은 아닌 것을 감안하더라도 그림 10과 그림 9의 ladder에서 나타난 band의 개수가 다르기 때문에 전기 영동이 충분히 이루어지지 않음을 확인할 수 있다. 물론 실험에서 사용한 sample A와 B와 비교해봤을 때 각각에 대응하는 band가 있다. 그러나 ladder가 정확하게 분리가 되지 않았기 때문에 염기쌍 및 DNA의 질량을 결정지을 수는 없다. 다만 Theory에서 소개한 Stokes 공식에 따라서 A와 B의 상대적인 정보의 평가만 가능할 뿐이다. Stroke식과 각 변수가 의미하는 바를 다시 정리해보자.

이때 같은 시간동안 전기 영동을 진행했으므로 각 시료가 이동한 거리와 속도가 비례하는 것을 이용할 수 있다. 그리고 같은 조건에서 전기영동을 진행했기 때문에 몇 가지 변수들은 모두 상수로, 거리에 차이가 발생하는 것에 영향을 주지 않을 수 있다. 이 변수들은 , 그리고 에 해당하여 상수로 표현된다. 따라서 각 시료의 이동 거리는 와 사이의 비율에 의하여 결정되는 것을 확인할 수 있다. 두 변수는 서로 비례관계에 놓여있기 때문에 정확한 수치적 비교는 할 수 없다. 다만 더 많은 거리를 이동한 sample A가 sample B보다 크기에 비해서 더 음의 전하를 나타내는 것 밖에 얻어낼 수 없다.

 

6. Reference

1) 강호일, 전기영동 최신 프로토콜, 월드사이언스, 2006, pp. 14~25

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실험 결과 해석을 위해 필요한 개념

DNA의 구성 및 구조

전기영동의 개념과 물질 이동 속도 결정

전기영동의 종류

Gel loading dye