화공노트: 화학공학 살펴보기

Ⅰ. Title

입도분석 (Particle Analysis)

Ⅱ. Purpose

이 실험을 통해서 입자(particle)의 제타포텐셜과 입자의 크기(size)를 구한다. 또한 sample의 pH가 변화함에 따라 이 용액속에 분산되어 있는 입자의 제타포텐셜과 입자의 크기가 크기를 구해본 후 변화 정도를 계산하여 각 요소 사이의 관계를 이해한다.

Ⅲ. Theory

1. pH와 등전점

1) pH

pH는 용액이 어느 정도의 산도를 갖고 있는지를 보여주는 지표이며, 용액 속의 수소이온 농도 [H+]를 이용해서 측정한다.

2) 등전점(isoelectric point, pI)

양쪽성 이온과 같은 물질처럼 어떤 물질들은 전하량의 분포가 다양하다. 일정 조건 하에서 물질의 알짜 전하량이 0이 되는데, 이 지점을 등전점이라고 한다. 대표적으로 등전점을 가지는 물질은 이양성자산이다. 이양성자산의 등전점은 1차 pKa와 2차 pKa의 평균값이다.

산 해리 상수 pKa는 알려져 있는 경우도 있지만, Henderson-Hasselbalch equation (HH equation)을 이용하면 미지의 물질을 사용하더라도 측정한 pH와 산과 짝염기 사이의 농도비를 이용해서 측정을 할 수 있다.

2. 콜로이드와 제타포텐셜

1) 콜로이드(colloid)

용질의 형태가 비교적 커서 용매에 입자들이 분산된 형태가 관찰될 수 있는데, 이처럼 어느 정도 이상의 크기를 갖고 있는 입자를 콜로이드라고 한다. 콜로이드의 표면적은 비교적 크기에 이를 구성하는 작용기의 이온화 또는 용매의 입자의 흡착 등으로 정전기적 전하를 가질 수 있게 된다. 즉 콜로이드 입자가 (+)전하 또는 (-)전하로 대전이 되어있으며 그 주위를 반대 전하를 갖는 물질(이온)이 둘러싸서 열운동(e.g. 브라운 운동)을 할 수 있게 된다.

2) 제타 포텐셜(Zeta potential)

콜로이드가 전하를 띠게 된다면 이온 흡착 등을 따라서 이온들이 콜로이드 주변에 흡착될 수 있다. 다만 단순히 하나의 층을 이루는 것이 아닌, 전기 이중층(Electric Double Layer)을 형성한다. 콜로이드 표면에 인접한 외부에는 Stern Layer가 형성되고, 이는 잘 움직이지 않는다. Stern Layer의 밖에는 Diffused Layer가 형성되며, 이온들과 극성 액체 분자들이 steady-state configuration을 가지며 상대적으로 활발히 움직인다. 각 Layer의 표면마다 surface potential을 결정할 수 있는데, Diffusion Layer의 surface인 slipping plane의 potential을 제타 포텐셜(zeta potential)이라고 한다. 콜로이드가 갖고 있는 전하에 따라서 형성되는 EDL과 그에 따른 Zeta Potential의 약간의 차이가 있는데, 그림 1에는 콜로이드의 surface charge가 negative인 경우를 나타낸 것이다.

제타 포텐셜은 콜로이드의 Stability를 나타낸다. 제타 포텐셜의 절댓값 이 높으면 그만큼 콜로이드는 더 잘 분산된다. 그렇지 않은 경우 콜로이드가 응집할 수 있으며, 제타포텐셜의 범위와 그에 따른 콜로이드의 안정성을 그림 2로 나타냈다.

3. DLVO theory

콜로이드는 DLE를 형성하고 있기에 여러가지 상호작용이 나타날 수 있다. 이 시스템에서는 Van Der Waals 상호작용, EDL에서의 Repulsion과 Attraction, 그리고 다른 입자들 사이에서 관찰되는 Born Interaction이 있다. 해당 상호작용을 모두 더해서 관찰되는 알짜 potential을 얻을 수 있으며, 이 potential을 기준으로 콜로이드의 Stability를 나타내는 것을 DLVO theory라고 한다.

물질들은 최대한 안정한 에너지를 유지하려 하며, 그림 3의 DLVO model에서도 낮은 에너지 준위를 유지하려 한다. 입자들의 사이가 어느 정도 가깝다면, 아예 그 거리를 최소화해서 (i.e. 응집(coagulation)과 응결(flocculation) 진행) 안정성을 유지하려 한다. (Primary Well) 이에 반해 입자들 사이의 거리가 어느정도 멀다면 입자들 사이의 거리를 어느 정도 유지해서 시스템의 안정성을 유지하려 한다. (Second Well)

4. 동적 광 산란법 (DLS Method)

콜로이드의 물성은 보통 nanoparticle analyzer을 이용해서 측정한다. 기기는 각각의 방식을 따라 물성을 측정하지만, 동적 광 산란법 (Dynamic Light Scattering, 이하 DLS)은 많이 사용되는 방법이고 이번에 실험에서 사용되는 SZ-100도 이 기법을 이용해서 콜로이드를 관찰한다.

5. Stokes Einstein: 입자의 거동성과 입자 움직임 사이의 관계

solution에서 작은 입자(용질, 콜로이드 등)은 무질서한 움직임을 보이고, 이를 브라운 운동이라고 한다. 물질의 물리적 거동성을 이용하면 입자의 크기를 정할 수 있는데, 그 중에서 브라운 운동과 입자의 크기 사이의 관계를 보이는 식이 Stokes Einstein Equation이다.

Ⅳ. Chemicals & Apparatus

1. Chemicals

증류수, 6N HCl 용액, 6N NaOH, 1mL 10% bead solution, pH Standard solution (4.01, 10.00), Titanium Dioxide Solution, sample base

2. Apparatus

pH meter, 100mL 비커, magnetic stir bar, stirrer, micro pippet, pippet tip, nano particle analyzer(SZ-100), electrode cuvette, open disposable cuvette

Ⅴ. Procedure

1. pH meter를 이용한 pH 조정

1) 비커에 0.14g의 TiO2 Solution을 정량한 후 50mL 증류수를 담은 후, magnetic bar를 비커에 넣고 5분 정도 stirring을 진행한다. (sample base)

2) pH standard solution을 이용해서 pH meter기의 Calibration을 진행한다.

3) pH meter기를 이용해서 stirring을 하고 잇는 sample base의 pH를 측정한다.

4) NaOH나 HCl을 추가하면서 적절히 pH를 조정한다. (이번 실험에서는 pH 2.01, 3.38, 8.76, 9.99)

2. Zeta Potential 측정

1) electrode cuvette에 정량한 시약을 200μL를 넣는다.

2) 기기를 다음과 같이 Setting한다.

- Measurement duration = 80 ~ 120s, Standard Calculation, Measurement time = 3~5 min

3) SZ-100에 샘플을 넣은 후 기기를 작동시켜서 Zeta potential을 측정한다.

3. Particle Size 측정

1) 4 open disposable cuvette에 정량한 시약 1mL를 넣는다.

2) 기기를 다음과 같이 Setting한다.

- Measurement duration = 80 ~ 120s, Standard Calculation_advance_volume, Measurement time = 3~5 min

3) SZ-100에 샘플을 넣은 후 기기를 작동시켜서 Particle Size를 측정한다.

Ⅵ. Data & Result

Ⅶ. Discuss

1. Colloid Particle Surface (Charge) 조정

이번 실험에서 사용하는 물질은 TiO2이다. 이 물질은 놓여있는 pH 조건 하에서 표면의 전하가 바뀌고, 이는 Zeta potential을 결정한다. 알짜전하가 0인 등전지점을 기준으로 상대적으로 수소이온의 농도의 차이에 따라 TiO2 표면의 전하가 어떻게 변하는 지를 아래의 그림 9에 표현했다.

즉 acidic solution에서부터 TiO2의 Surface charge를 측정하면 (+) -> 0(pI) -> (-)로 변한다. (TiO2의 pI는 6.9정도로 알려져 있다.) 우리가 측정하게 되는 입자는 DLE를 포함한 가상의 입자이지만, 이때에도 surface의 charge는 순수 콜로이드 입자와 동일하며, Zeta potential도 (+) -> 0(pI) -> (-)로 변화한다. 실제로 측정 결과를 보면 아래의 그림 10의 Zeta potential을 보이며 측정하는 TiO2의 phase에 따라 다르게 관찰되는 것 또한 알 수 있다.

2. Zeta Potential 측정 원리

nano particle analyzer(이하, SZ-100)가 property를 어떻게 측정하는 지를 살펴보자. 이상적인 pI에 위치하지 않은 입자들은 전하를 띠고 있기에 전압에 의해서 입자들이 움직이게 된다. (입자가 pI에 위치해 있더라도 TiO2 산소 등을 포함하고 있기에 외부에서 전압을 지속적으로 가하면 입자가 이동할 수 있다.) 여기서 입자의 이동 속도를 이용해서 표면의 전하를 측정하면 Zeta potential을 얻을 수 있으며, 이동에 의한 입자들의 dispersion 정도를 측정하면 입자의 크기를 알 수 있다. Zeta potential은 입자의 mobility를 이용해서 측정한다. mobility는 system에 작용하는 외력에 대한 입자의 이동속도의 비율을 이용해서 얻으며, 실험의 상황과 해당 식들을 아래에 표현했다. (전압을 가해서 입자를 움직이는 방식은 전기영동에서 나타나는 설명과, 해당 현상을 해석하는 방식과 유사하다.)

3. 입자 크기 측정 원리

Z-100은 초기의 입자 배치를 기준으로, 전압을 가하는 시간에 비례하여 입자들의 움직인 정도를 분산 정도로 생각하여 입자의 움직임 정도를 결정한다. 실험에서 사용한 기기로는 입자의 순수한 크기는 측정하기 힘들며, hydrodynamic diameter(Dh ), 즉 입자가 들어있는 media가 TiO2를 주위를 감싸고 있는 가상의 입자의 직경을 재는 것이다. 이는 Stoke-Einstein equation 통해 결정된다.

Dh=kBT3πηDt

이때 SZ-100은 Dynamic Light Scattering (이하, DLS) 기법을 이용해서 입자가 media에서 어떻게 거동을 보이고 있는 지를 결정하며, 이는 Translational diffusion coefficient(Dt )로 표현된다. SZ-100은 입자의 브라운 운동 정도를 파악하기 위해서 cuvette에 전압을 가한다. (이번 실험에서는 2V 정도의 전압을 이용했다.)

위의 그림에서 표현된 것처럼 측정하고자 하는 입자의 모든 크기들이 균일하지 않다. 그렇기에 해당 system에 빛을 쏘았을 때 각각의 입자에 대해서 scatter 정도를 측정하고, SZ-100이 이 정보들을 모아서 Autocorrelation Function(G2(τ), 이하 ACF)를 얻어내며, 해당 그래프와 식은 아래와 같다.

위의 식 중 q를 결정하는 변수는 refractive index of the liquid(굴절률, n), wavelength of the laser light(광원의 파장, λ), scattering angle(빛의 산란 각도, θ)가 있다. 이 식이 어떻게 Dt(위의 식에서는 Dm)이 결정되는지를 살펴보기 위해서 이번 실험에서 얻은 pH 8.76에서의 Data를 이용해보자.

ACF식과 실험 결과로 얻은 식을 비교하면 여러 계수들의 값을 결정할 수 있으나, 우리가 중요하게 여길 계수는 exp안에 들어있는 -0.004이다. 지수 안의 수는 무차원(dimensionless)을 유지해야 하므로 실제로는 -0.004/s인 것을 알 수 있다. 이를 이용해보자.

Dt의 차원은 L2/T이고, 오른쪽 항의 계산식의 차원 또한 T-1×(L/dimensionless)2=L2/T이다. 즉 죄/우 항의 차원이 같은 것을 알 수 있으므로, 식의 유도가 성립함을 알 수 있다. 다만 굴절률, 광원의 파장, 빛의 산란 각도는 Excel 파일에 따로 없었으며, 이들을 반영하여 Dt를 결정한 것으로 보인다. 이 값을 얻은 후 Stoke-Einstein equation에 대입하면 Dh를 얻을 수 있다. (이번 실험에서의 T는 25℃이며, viscosity η는 0.893 mPa∙s정도였다.)

4. 실험 결과 해석

이제 이번 실험에서 얻은 데이터들을 살펴보자.

1) Zeta potential

그림 7과 그림 10을 합쳐서 알려져 있는 Zeta potential과 이번 실험에서 실제 측정한 Zeta potential의 경향성을 비교해보자.

우선 TiO2 system의 pH가 증가할수록 입자의 전하가 (-)로 변하므로 Zeta potential도 (-)를 보여야 한다. 실험 결과 Zeta potential의 크기 차이는 적지만 확실히 양의 값에서 음의 값으로 감소하는 경향성을 보인다. 일반적으로 알려져 있는 pI = 6.9 정도로 Received dry TiO2에서 관찰할 수 있다. 하지만 직접 측정한 Data에서 pI는 3.5 ~ 4에서 형성이 된 것을 확인할 수 있다. 해당 수치는 Slurry 형태의 TiO2의 pI와 거의 유사한 수치이다. 그렇기에 실험에서 사용한 TiO2 콜로이드 입자들이 매우 인접한 거리에 있었다는 것을 생각할 수 있다. (예상하던 것 보다 고농도의 시료가 사용된 것처럼 측정이 됨) TiO2의 자체 침전성이 있기 때문에 이 이야기도 신빙성은 있다고 생각되나, Zeta potential 수치를 이용해서 설명해보자. 실험 결과 Zeta potential의 절댓값은 1.5보다 크지 않으며, 이 수치는 콜로이드가 매우 불안정한 상태를 뜻하며 콜로이드가 급격한 응결/응집을 일으킨다. 이는 DLVO graph에서 해당 콜로이드 system이 primary well으로 향하여 system의 안정성을 유지하려 하는 것이다. (그림 3 참조) 이 설명들을 통해서 우리가 측정한 system 내의 콜로이드들의 입자 사이의 거리가 매우 가까이 유지되어 slurry 형태를 유지함을 알 수 있다. 다만 콜로이드가 slurry가 될 때 입자가 ‘어떻게’ Slurry 상태로 도달하는 지에 대해 생각을 해봐야 하는데, 이는 입자의 particle size를 관측한 Data를 확인 후 설명하겠다.

2) particle size

TiO2 colloid에 대해 알려져 있는 입자 크기와 이번 실험에서 실제 측정한 입자의 크기의 경향성을 비교해보자.

reference와 실제 실험 결과를 통해서 입자의 크기를 분석한 결과 pH 2.02지점 에서의 입자들의 크기가 매우 크게 관측이 되었으며, 나머지 크기에서는 크기가 매우 작고, 비슷하게 측정이 되었다. pI 지점 근처가 아닌 입자들의 크기는 대부분 비슷하게 측정이 되었으므로 잘 측정이 되었다고 할 수 있다. pI 근처 지점에 대해 이야기를 해보자. pI 지점에서는 콜로이드가 입자들이 전하를 띠지 않으므로 전기영동에 의한 입자의 이동 정도가 매우 낮다. 즉, 입자의 mobility가 매우 낮기에 Dt가 작게 측정된다. 입자 반지름은 mobility와 반비례하기에 pI 지점에서는 입자의 반지름 크기가 매우 크게 측정이 된다. 이번 실험에서 pI는 3.5 근처에서 관찰이 되었는데, Experimental Data graph만 보면 그렇게 측정이 되지 않아 보인다. 하지만, 이는 시간 상의 문제로 Data의 수가 부족했기에 생긴 현상이며, Zeta potential 정보를 얻은 후 pI 지점을 계산해내서, 이 지점과 인근에서의 particle size를 측정해서 correlation graph를 얻으면 reference graph의 개형과 비슷한 모양의 그래프를 얻을 수 있을 것이다. pH 2.02 지점에서는 particle의 surface에 이온/극성 용매가 불규칙하게 부착되어 가상 입자의 크기가 매우 크게 측정이 되었거나, 전기 영동 등에 의해서 EDL의 찌그러져서 측정이 되어 실제 입자보다 더 크게 측정이 되었다고 생각할 수도 있다. 다만, 이 설명은 입자들이 충분히 안정하여 자체적인 거리를 유지할 수 있을 때 가능하지만 zeta potential이 해당 안정성을 보장해줄 수 없기에 다른 설명이 필요하다. 그림 2를 다시 살펴보자. 어떤 colloid system이 stability를 유지하지 못하면 입자들이 거리를 가까이하려 하는데, 이는 2가지 경로를 따라 진행된다. 첫 번째 경로는 입자들이 먼저 뭉친 후 서로의 거리를 가까이하는 Flocculation -> Coagulation -> Sedimentation 경로 (이하, FCS 경로)와 입자들이 거리를 가까이한 후 약간 뭉치는 Sedimentation -> Flocculation -> Coagulation 경로 (이하, SFC 경로)로 구분된다. FCS 경로의 경우 입자들의 크기가 매우 크게 형성이 되며, SFC 경로를 따르면 입자들의 크기가 작게 형성이 된다. Zeta potential의 수치를 보면 DLVO의 Primary Well에 위치하려 하기 때문에 FCS 경로와 SFC 경로를 반드시 거쳤음을 알 수 있다. pH 2.02 지점에서는 입자의 크기가 큰 것을 봐서 FCS 경로를 따라서 형성된 Slurry인 것을 예상해볼 수 있으며, 나머지 pH 지점에서는 입자의 크기가 작은 것을 봐서 SFC 경로를 따라서 Slurry가 된 것을 예상할 수 있다. 이번 실험에서는 측정하지 않았지만 보통 입자와 관련된 실험을 진행하면 입자의 광학적 정보를 같이 측정한다. 만약에 이번 실험에 optical data를 얻어내는 과정이 있었다면 Slurry처럼 입자 사이의 거리를 가깝게 유지하는 것은 같으나, pH 2.02 지점에서는 자갈이 서로 가깝게 쌓여 있는 모양을 하고 있을 것이고, 나머지 지점에서는 모래가 서로 가깝게 쌓여 있는 모양을 하고 있을 것이라고 생각할 수 있다.

3) pH - Particle size - Zeta potential size 사이의 관계 및 실험에 영향을 미칠 수 있는 추가 요인

경향성을 편하게 설명하고자, pH 2.02지점과 나머지 지점을 분리해서 설명하겠다. pH가 낮은 지점에서 particle size가 유독 크게 측정이 되었다. 앞서 이를 EDL의 찌그러짐, FCS 경로에 의한 현상이라고 이야기를 했다. 이는 pH와의 연결고리가 크지는 않다. pH에 의한 효과를 생각해보자면 Steric effect를 생각해볼 수 있다. 그림 9를 살펴보자. pH < pI에서 TiO2의 표면은 산소 하나에 수소 2개가 연결되어 있는 형태를 유지하고 있다. 이는 pI 지점과 pH > pI 지점에서의 TiO2 표면보다 입체적으로 방해가 더 높아서 이온들이 흡착되어 layer를 형성하기 어려워진다. 그렇기에 하나의 안정한 EDL을 형성하기 위해 더 많은 상호작용을 요구하고, 많은 입자들이 넓은 범위에서 관여하기 때문에 입자의 크기가 특별히 크게 측정이 되었다고 예상된다. 실제로 위에서 사용한 Reference Data들을 보면 모두 pH 2 지점에서의 측정을 피하고 pH 3 이상에서 정보들을 얻어낸 것을 확인할 수 있다.

colloid를 포함하는 system은 particle size와 distance among colloids를 구분해서 설명할 수 있어야 하며, 이는 pH의 변화에 의해 설명이 가능해진다. pH 2.02 인근 구간을 제외하면 pH의 단조 증가/감소에 대해 설명하는 것이 아닌, pI로부터 얼마나 pH가 멀리 떨어져 있는 정도를 중요하게 생각해야 한다. pH - pI 가 증가할수록 입자의 전하가 증가하므로 Zeta potential도 증가한다. 이는 Colloid의 안정성이 더 높다는 것을 뜻하므로 Particle의 Size는 더 작은 상태를 유지할 수 있게 된다. 그리고 Zeta potential의 증가는 Particle 사이의 거리도 일정 간격을 가질 수 있는 가능성을 시사한다. DLVO graph에서 primary well과 secondary well 사이의 에너지 준위 차이가 존재하는데, Zeta potential이 증가하면 이 에너지를 넘어서 입자가 Secondary well로 배치될 수 있다. 이 지점은 입자 사이의 거리가 있지만 에너지가 local minimum을 보이고 있는 지점이기 때문에 주변부에 비해 상대적으로 에너지가 낮으며, 안정한 system을 유지할 수 있게 된다. 직접 수행한 실험에서도 pI 인근의 점이 아닌 pH 8.76 -> 9.99 구간에서도 Zeta potential의 절댓값이 0.5 -> 1.2로 증가하고 이에 따라 particle size가 137.0 -> 132.7로 감소하는 것을 관찰할 수 있다.

마지막으로 particle size에 영향을 줄 수 있는 요인들에 대해 생각해보자. 우선 측정에 사용한 sample이 균일하게 섞이지 않았을 수 있다. 측정을 위해 stirring을 멈추면 전하를 갖고 있는 입자들은 서로 엉키게 되어 cuvette내에서 제대로 분산이 안될 수 있다. 또한 system의 이온 강도를 고려해야 한다. pH 조절을 위해서 HCl과 NaOH를 이용하는데, 과도한 이온강도는 더 압축된 EDL을 형성하게 한다. 이는 particle size에 직접적인 영향이 간다. 또한 media의 극성에 따라 입자의 크기가 다르게 측정된다. media가 극성인 경우에는 입자의 크기와 EDL의 크기의 차이가 적다. (Smoluchowski attraction) 반면 무극성 용매를 사용하는 경우 안정화를 위해 이온이 많이 관여하므로 상대적으로 EDL의 크기가 크다. 그리고 기기의 조건 등도 영향을 줄 수 있다. 먼저 pH meter가 pH를 정확하게 측정하지 못할 수도 있다. (또는 정확한 pH 측정까지 필요한 시간보다 짧은 시간 내에 측정을 완료했다고 판단하는 경우) 그리고 SZ-100의 광학적 배열도 영향을 미칠 수 있다. 입도 분석처럼 높은 정확도를 요구하는 실험은 다양한 범위에서의 데이터를 측정하여 Correlation의 정확도를 높이고, 각 수치에서의 측정을 여러 번 진행하여 측정의 정확도/정밀도 등을 개선해야 한다.

Ⅷ. Reference

1. Terence Cosgrove, Colloid Science principles, Methods and Applications 2nd, WILEY, 2010

2. HORIBA, A GUIDEBOOK TO PARTICLE SIZE ANALYSIS, HORIBA INSTRUMENTS, INC., 2019

3. HORIBA, Nanoparticle Analyzer nano partical SZ-100 Series, HORIBA INSTRUMENTS, INC.

4. Tiziana Tosco외 2인, Transport and Fate of TiO2 nanoparticles in soil and aquifers, Politecnico di Torino, 2017

Ⅰ. Title

High Performance Liquid Chromatography (HPLC)

Ⅱ. Purpose

1. HPLC의 이론 및 기기조작을 통하여 혼합 액상의 성분을 분석한다.

2. 크로마토그래피의 원리와 물질의 몰흡광계수를 통해 시료의 정량, 정성 분석 방법을 익힌다.

Ⅲ. Theory

1. 크로마토그래피(chromatography)의 정의와 종류

크로마토그래피는 혼합물 중 유사한 성분들을 띠는 물질들을 분리할 수 있는 분리법이다. 이 분리법은 이동상-시료-정지상 사이의 상호작용을 이용해서 물질을 분리해낸다. 그래서 이동상을 기준으로 기체 크로마토그래피와 액체 크로마토그래피로 분류할 수 있다. 또한 정지상의 형태에 따라 column 크로마토그래피, 평면 크로마토그래피, 얇은 막 크로마토그래피로 분류할 수 있다. 뿐만 아니라 이동상-정지상 사이의 특이한 상호작용을 이용하는 친화성 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 그리고 크기 배제 크로마토그래피가 존재한다. 

2. 이동상(mobile phase)과 정지상(stationary phase)의 특성

1) 이동상과 정지상의 특성 - 정상 크로마토그래피와 역상 크로마토그래피

일반적으로 크로마토그래피는 이동상과 정지상, 그리고 시료 사이의 상호작용 정도로 혼합 시료를 각각의 성분으로 분리할 수 있다. 이동상 내의 시료와 정지상의 친화도가 강하다면 시료가 더 느리게 이동한다. 반면, 친화도가 낮다면 이동상을 따라서 빨리 이동할 수 있으며 이는 더 빠른 분류를 할 수 있다. 이처럼 물질 사이의 상호작용으로 시료의 이동 정도를 구분할 수 있다. 분자간 상호작용을 구분 짓는 큰 기준은 분자의 극성 여부이다. 이동상과 고정상 사이의 극성을 어떻게 설정하는 가에 따라 크로마토그래프는 2가지 종류로 구분되며, 이를 아래의 표로 정리하였다.

표  SEQ 표 \* ARABIC 1 정상 크로마토그래피와 역상 크로마토그래피의 비교

2) 이동상의 이동방법

column을 이용하는 크로마토그래피의 경우, 시료를 위에 넣어 아래에서 시료를 분리하는 형태를 취하는 경우가 많다. 이 과정에서는 중력을 drive force로 하여 분리가 진행될 수 있으나, 더 높은 효율 원하면 압력 차이를 이용할 수 있다. 대표적인 예시로는 이번 실험에서 사용하는 HPLC 기법이 압력을 이용하여 크로마토그래피를 이용할 수 있다. 이는 drive force 세기의 차이로만 설명할 수 있으며, 실제로 보이는 이동상의 이동 방법의 원리는 2가지 정도가 있다.

① 등용매용리(Isocratic Elution)

isocratic elution은 시간의 흐름에 따라 이동상의 조성이 일정한 이동상의 흐름을 의미한다. 그러므로 column 내에서 이동하는 시료의 이동속도는 시간이 지나도 고유한 값을 갖는다. 즉, 혼합물 시료 중 각 성분의 극성 등 특성에 따라 다른 이동 속도를 보여줄 수 있으나 그 속도는 시간에 대한 등속도 운동을 보이는 것을 의미한다. 또한 column에 가해지는 압력도 서로 일정하게 설정하는 경우가 많다. 다만 분리하고자 하는 혼합물의 polarity 범위가 넓다면 친수성 물질의 경우 column retention이 좋지 않아 빠르게 용출이 될 수 있으며 소수성 물질의 경우에는 retention이 지나치게 발생하여 용출이 되지 않을 수 있다.

② 농도구배용리(Gradient Elution)

gradient elution은 시간의 흐름에 따라 이동상의 조성이 변하는데, 역상크로마토그래피에서는 용리 정도가 증가하도록 변한다. 이는 시간에 대해 이동상 중 유기 용매 비중이 증가하기 때문에 시료의 이동속도가 증가한다. 이와 같은 특성 때문에 resolution이 개선되고, separation efficiency가 증가하나, 이동상 조성이 변하기 때문에 상호 작용의 변화로 침전이 발생할 수 있다.

3) 이동상(용매)의 설정

이동상(용매)에 따른 분리의 특성이 변하므로, 특성을 고려하여 이동상(용매)을 결정하는 것은 중요하다. 이동상이 가져야 할 물리적 성질에는 검출이 용이해야 하며 점도 및 순도가 적당해서 이동이 잘 진행되어야 한다. 화학적 성질로는 이동상이 고정상을 녹이면 안되며, 시료 분자와 화학적 상호작용을 보이면 안된다. 또한 용매 세기를 잘 설정해야 한다. 설정한 용매가 complex일 때 용매의 부피 비율을 Fn, 각 성분의 고유한 용매 세기를 Sn이라고 할 때 전체 용매 세기를 얻을 수 있다.

다만, 용매 세기를 너무 높게 설정하면 고정상과의 상호작용이 크게 발생해 분리 자체가 발생하지 못하며, 너무 낮게 설정하면 고정상과의 상호작용이 거의 일어나지 않아 용매의 이동에 문제가 발생할 수 있다.

3. Chromatogram - 크로마토그래피 결과 분석

분석하고자 하는 크로마토그래피의 종류, 이동상/고정상 설정을 마친 후 실제로 분리를 진행하면 chromatogram을 얻을 수 있다. 크로마토그램을 이용하면 진행한 실험에 대해 몇 가지 정보를 얻을 수 있다. 이번 실험에서 사용하는 크로마토그래피는 액체크로마토그래피이므로 이를 기준으로 표현하겠다.

1) 용량인자, 크기인자 (Capacity factor k’)

용량인자는 이동상 및 시료가 고정상 (column)에 머무르는 정도를 표현한다. 이는 시료와 고정상이 얼마나 상호작용을 할 수 있는가를 표현하는 척도이다. 분리하고자 하는 시료의 성분이 column을 거쳐 분리된 상태로 용출되어야 하므로 서로 다른 용량인자 k’ 값을 보여야 한다. Capacity factor는 아래의 식과 같다.

Retention time은 시료마다 고유한 값을 갖는다. 또한 capacity factor의 값과 시료가 column에 머무르는 정도는 비례한다. 또한, capacity factor와 분리 정도는 비례하나, 그만큼 bandwidth W의 크기도 증가한다.

한편, Capacity factor는 column내에서 분배가 진행되는 과정 중 자유 에너지의 변화를 관찰할 수 있다. 이는 분배 계수(distribution coefficient)에 비례한다. 분배 계수는 이동상을 용매로 갖는 시료의 용해도에 대한 고정상을 용매로 갖는 시료의 용해도의 비 값을 말한다. capacity factor와 분배계수 사이의 관계를 수식으로 표현하면 다음과 같다.

이를 이용하면 capacity factor로 이동상 및 고정상에 들어있는 시료의 양을 표현할 수 있다. 이를 표현하면 다음과 같다.

2) 선택성, 분리인자 (Separation or Selectivity factor, α)

selectivity factor는 분리하려고 하는 시료들에 대한 capacity factor의 비율이다. selectivity factor의 값이 1이면 두 시료가 분리되지 않음을 뜻하고, 1보다 클 때 두 혼합 시료가 분리되었다고 판단할 수 있다. α를 식으로 표현하면 다음과 같다.

3) 컬럼효율 (Column Efficiency)

column efficiency는 컬럼단이론(plate theory)를 이용해서 설명할 수 있다. 우선, 효율을 식으로 표현한 후 설명해보도록 하겠다. 여기서 N을 이론단수(Theoretical Plate Number)라고 하자.

N은 컬럼 효율의 척도를 표현하며, 주어진 실험 조건이 일정할 때 그 값은 거의 변하지 않는다. 해당 변수의 예시로는 이동상의 유속, 온도, 시료 주입의 조건 등이 있다. 컬럼효율은 시료가 컬럼을 통과하는 동안 발생하는 녹는 정도의 띠이며, 넓힘 현상의 정도를 말한다. 이는 이동상에 대한 분자들이 서로 다른 속도로 이동하며, 그 과정에서는 확산과 물질전달 등의 효과가 수반되기 때문에 관찰되는 현상이다.

한편, HETP는 Van Deemter Equation을 이용해서 표현할 수 있다. Van Deemter Equation은 다음 식을 따른다.

각 항이 갖는 의미에 대해 설명하며 HETP의 의미를 살펴보자.

A항은 소용돌이 확산(eddy diffusion) 효과를 표현한 식이다. (multiple paths term) 분자가 이동상을 따라 이동할 때 고정상과의 상호작용을 수반하는데, 이때 시료의 각각의 입자의 flow path는 달라진다. 이 경로의 차이는 시료들의 retention time에 영향을 미친다. 다만 이동상과 고정상을 그대로 유지하는 경우, 값은 일정하게 나타난다.

B항은 이동상에서 분자가 확산되는 정도를 의미하며, 이는 peak의 height가 커지는 정도를 의미한다. 용질은 고농도 지역에서 저농도 지역으로 이동하므로 띠의 중심에서부터 띠의 가장자리로 확산된다. 유속이 빠르면 그 정도가 감소하므로 반비례 관계를 보인다. 마지막으로 C항은 mass transfer의 정도를 의미한다. 이는 시료가 이동상과 정지상 사이에서 이동할 수 있는 정도를 의미한다. 만약 flow rate가 빨라지면 이동상-고정상 사이에서 평형이 발생하지 않고 시료가 이동하기 때문에 peak의 너비 W가 증가한다.

위의 A, B, 그리고 C항을 고려하면 column의 효율을 증가할 수 있다. (분리능 R의 조정)

① column의 길이를 증가시킨다. (다만, 지나치게 용리가 되지 않도록 조심해야 한다.)

② 이론적 column층의 높이 HETP의 높이를 줄인다.

한편 이론단수 N의 값도 효율을 표현할 수 있는데, 이는 다음과 같은 변수들에 의해 조정될 수 있다.

① column을 채우고 있는 입자의 크기를 줄일수록 N은 증가한다.

② flow rate과 N은 반비례관계이다. 즉, flow rate가 감소할수록 N은 증가한다.

③ 이동상의 점도가 낮아질수록 N은 감소한다. (점도와 N은 비례관계)

④ 이동상의 온도가 높을수록 N은 증가한다. (온도와  반비례관계)

⑤ 용질의 크기가 증가하면 N의 크기는 감소한다. (크기와 N은 반비례관계)

4) 분리도 (Resolution R)

이 척도는 주입한 시료가 최종적으로 용출될 때 column에 의하여 각 성분이 어느 정도로 순수하게 분리가 되었는지를 보여주는 척도이다. 이는 앞의 capacity factor, selectivity, 이론단수를 이용해서 정의한다.

이 식을 통해서 혼합 시료 내에서 설계된 크로마토그래피에 대해 비슷한 성질을 갖는 성분들이 분리된 정도를 표현한다.

위의 그림은 분리도 값에 따른 chromatogram을 표현한 것이다. 유사한 성질을 띠는 두 성질이 완전히 분리되었다고 판단할 수 있는 지점은 R=1.5이상일 때로 생각한다.

4. HPLC의 구성

HPLC는 이동상을 액체로 갖는 크로마토그래피이며, 분리가 빠르게 진행되도록 높은 압력이 필요하기 때문에 High Performance 또는 High Pressure Liquid Chromatography라고 한다. HPLC 기기는 다음과 같은 구성을 갖는다.

* 실험에서 사용한 HPLC의 특성을 표현하기 위하여 매뉴얼의 내용을 편집없이 그대로 기술하였다.

1) 이동상 저장기

이번 실험에서 사용하는 HPLC 기기는 하나 또는 그 이상의 저장기를 갖고 있으며, 이는 유리 또는 스테인레스 스틸로 구성되어 있다. 이 저장기에는 용해된 기체(일반적으로 산소)를 제거하는 장치가 붙어있다. 이동상에 공기가 녹아 있으면 기포가 발생하여 유속이 변하고 검출기의 성능을 떨어뜨리므로 사전에 제거해야 한다.

2) 펌프 장치

HPLC 펌프 장치는 이동상을 일정하고 재현성 있게 컬럼에 공급해야 하며, 아래의 조건에 부합해야 한다.

① 6000psi 까지 압력 발생이 가능해야 한다.

② 0.1∼10mL 사이의 흐름속도를 조절할 수 있어야 한다.

③ 펌프에서 나오는 용매의 공급은 펄스가 없어야 한다.

④ 펌프 내의 부분 장치는 부식되거나 용매와의 화학적 상호 반응이 없어야 한다.

⑤ 유속의 속도 및 유속의 재현성은 0.5 % 이내를 유지하여야 한다.

3) 시료 주입 장치

일정한 용매의 흐름에 대한 영향을 최소화하며 일정한 양의 시료를 주입하는 장치이다 시료의 주입은 용리 띠 현상 때문에 가능한 적게 주입하는 것이 좋다. 따라서 시료의 주입 부피는 가능한 작은 것이 좋다.

4) 컬럼

컬럼은 정지상을 충전한 좋은 분리관을 말한다. 컬럼의 재질, 모양 및 서로 다른 두 컬럼 사이의 연결 등이 분리에 매우 큰 영향을 미친다. HPLC 컬럼은 일반적으로 높은 압력이 필요하므로 이 압력에 견딜 수 있어야 한다.

5) 검출기

이상적인 검출기는 다음 특성을 갖추어야 한다.

① 높은 감도와 모든 분석 물질에 대해서 같은 감응도를 가져야 한다.

② 넓은 범위에서 선형적인 감응을 나타내야 한다.

③ 온도나 이동상의 흐름에 영향을 받지 않아야 한다.

④ 짧은 시간에 감응해야 한다.

⑥ 이동상이 감응하지 않아야 한다.

⑦ 용리 띠의 넓힘 효과가 없어야 한다.

⑧ 용질을 파괴하지 말아야 한다.

⑨ 신뢰도가 높고 사용이 편해야 한다.

Ⅳ. Chemicals & Apparatus

1. Chemicals

1) 400ppm R, T, X (용매 Acetonitrile 10mL + 시료 4 μl)

2) benzene, toluene, xylene, 미지시료 1, 미지시료 2

2. Apparatus

- HPLC

Ⅴ. Procedure

1. 기기 실행 및 연결 준비

1) HPLC 기기의 기계를 열어서 사용할 column의 연결이 되어 있는지 확인한다. (사용하는 column : 4.6 × 150mm C185μm column)

2) 사용하려고 하는 이동상(ACN : DW = 6:4)이 A번에 연결이 되어 있는지 확인 하고, 이동상이 400mL 이상 남아있는지 확인한다.

3) HPLC 기기의 Vacuum degasser, Quaternary pump, Column compartment, UV/Vis detector의 네 칸의 기기의 전원을 모두 작동한다.

4) 컴퓨터의 전원을 켜고 바탕화면에 있는 autochro-3000 프로그램을 실행한다.

5) 왼쪽 상단에 있는 분석목록을 누른 후 사용자 로그인을 한다. (비밀번호 없이 로그인) - 프로그램을 보면 사용자 로그인이 되어 있지 않기 때문에 왼쪽 하단을 보면 제어목록이 비활성화 되어있는 상태임을 확인할 수 있다.

6) 왼쪽 하단의 제어목록이 활성화되면, 제어목록으로 창을 전환한 후, 왼쪽 상단의 제어목록을 누른 후, 제어목록 열기 버튼을 누르고, 제어목록을 실행한다. 이때, 왼쪽 중앙 제어목록들 하단에 이미 실행되고 있는 제어목록이 있으면 우클릭을 하여 제어목록을 닫는다. (바탕화면 HPLC 폴더에 9100 file)

7) 연결이 될 때까지 기다린 후, 각 기기별 상태가 빨간색으로 뜨면, 화면 중앙에 실행되고 있는 제어 목록을 누른 후, 제어 목록 다시 열기 버튼을 누른다. 기기별 상태가 검은색으로 뜨고, 제어목록들 하단에 기기들의 연결이 완료되면 참조광량과 샘플광량이 50 이상의 값에서 안정화가 될 때까지 기다린다. (기기 이름 오른쪽에 ~ : 연결 되는 중, *: 연결 오류) (50 이하로 떨어질 경우 lamp의 교체가 필요하다.)

8) 분석 분비 버튼을 누르고, 기기 이름 오른쪽에 ~ 표시가 사라진 것을 확인한다.

9) PUMP를 더블 클릭하여 pump 창을 활성화하고, PUMP를 우클릭해서 추적그래프를 연다.

10) 연결된 이동상이 A 100% B 0% C 0% D 0%로 되어있는지 확인한 한다. (A번에 제대로 연결이 되어있는 지 확인) 하단 유속값에 0.3mL/mim을 넣은 후 적용 버튼을 누르고 작동 버튼을 누른다. PUMP창 상단의 상태에 유속 값이 변하는 지 확인한다.  

11) 이동상이 흐르고 있는 관에 있는 기포를 제거하기 위해 프라임 단계를 진행한다. Quaternary pump(HPLC 기기의 두번째 칸)에 있는 valve를 왼쪽으로 끝까지 돌린 후, 압력이 0으로 떨어진 것을 확인 한 후에, PUMP 창에서 프라임 시작 버튼을 누른다. 프라임이 제대로 진행되고 있는지는 valve안에 있는 기포가 움직이는 것으로 확인할 수 있으며, 소리로도 확인할 수 있다.

12) 프라임을 30초 정도 진행한 후에 프라임 중지 버튼을 누르고, 왼쪽으로 끝까지 돌렸던 valve를 다시 오른쪽으로 끝까지 돌려서 잠근다.

13) 잠시 후 다시 압력이 올라가는 것을 확인하고, 추적그래프에서 압력이 stationary state이 되면, 압력을 0.8mL/mim으로 올린다.

14) 그 이후 0.2mL/mim의 압력을 더 올려 1.0mL/mim까지 올린다.

15) 유속이 1.0mL/mim인 상태에서 압력이 1500~2000psi 사이의 값에서 일정해지는지 확인한다. (유속 1.0mL/mim으로 올린 후, 8분 정도 유지해서 확인) 압력이 일정해지면 sample을 분석할 준비를 한다.

2. Sample 시료 분석 방법

1) 프로그램 창 중앙에 시료 목록에 기존에 사용되었던 시료목록이 기입되어있으면, 모두 삭제한다.

2) 시료 목록 창에 우클릭을 하여 시료 추가버튼을 누른다.

3) 시료 이름, 파일 이름, 시료 ID 값에는 분석하고자 하는 시료의 이름을 넣는다.

4) 제어방법버튼을 누르고, 찾기 버튼을 누른 다음 HPLC 폴더 안에 있는 ‘화공기초실험 HPLC 제어 min’을 모두 넣는다.

5) 분석목록 버튼을 누르고, 찾기 버튼을 누른 후, ‘화공기초실험 HPLC 7min’ 폴더를 열고 해당 그룹 폴더 안에 파일 이름을 넣고 열기 버튼을 누른다. 분석목록 파일 이름대로 새 파일이 생성된다.

6) 후처리 목록을 적분으로 설정한다.

7) Syringe에 시료를 넣고 (모든 시료는 30μL), syringe안에 기포가 없는지 확인해야 한다. 기포가 있으면 syringe 안의 시료를 버리고, 다시 syringe에 시료를 넣는다. (이때, syringe의 종류와 sample의 종류가 섞이지 않도록 주의한다.)

8) 기기 오른쪽 부분의 injection valve를 왼쪽 (load)로 돌린 후, syringe 바늘을 끝까지 넣은 후 injection한다. 그 후 valve를 오른쪽(inject)으로 돌리게 되면 분석이 시작된다.

9) 마찬가지로 모든 시료를 분석한다. (CAN, benzene, toluene, xylene, 미지시료1, 미지시료2)

3. 결과 분석 방법

1) 분석목록에 들어가서 분석하고자 하는 sample을 선택한다. (왼쪽 상단 분석목록 -> 열기 -> 파일) 또는 제어목록에서 이미 완료된 sample을 더블클릭한다.

2) Shift키를 누르고 peak 처음부터 끝까지 드래그 한 후 적분 초기화를 한다.

3) 원하는 peak를 shift키를 눌러서 드래그 한 후 강제 피크를 선택하여 면적을 구한다.

4. 종료 방법

1) 유속을 0mL/min으로 맞춘 후, 압력에 0psi에 도달하면 정지한 후, HPLC 프로그램을 끄고, 바탕화면 오른쪽 하단에서 usb를 제거하듯이, 프로그램 연결해제를 한 후에, HPLC 기기를 위에서부터 차례대로 종료한다.

2) 컴퓨터를 종료한다.

3) 흘러나온 이동상을 폐기물통에 버린다.

Ⅵ. Data & Result

2. 정량적 Data 분석

1) 정보정리

* Xylene의 RT는 가장 peak를 기준으로 고려했다. 구체적인 이유는 Discussion에서 다루겠다.

** RT를 고려하면 미지시료의 1st, 2nd peak를 표준시료의 혼합물로 생각할 수 있으며, 각 peak가 어떤 물질의 peak인지도 알 수 있다. 마찬가지로 구체적인 설명은 Discussion에서 다루겠다.

2) capacity factor k'  (용량인자)

'= t1R - t0 t0

- 이동상의 머무름 시간이 수치로 제시되지는 않았으나, geogbra로 좌표를 설정하여 내분 비율로 각 분석에 대한 t0 를 얻을 수 있다.    (t1R : 시료의 머무름 시간 t0 : 이동상의 머무름 시간)

3) Selectivity factor α (선택성)

α= t2R - t0 t1R - t0= t2'Rt1'R= k2'Rk1'R

- B-T/T-X/X-T에 대한 α와 미지시료의 α를 얻을 수 있다.

3) 이론단수 N과 이론단 높이 H

- 이론단수는 실험 데이터에 제시되어 있으나 아래의식을 통해서 계산할 수 있다.

N=16tRWb2=5.54tRW1/22

Wb : peak 최하단 부분의 길이 W1/2 : Wb 의 절반

- 4.6 × 150mm C18 5μm column을 사용하므로 컬럼의 길이는 150mm로 두고 계산을 진행했다.

HETP (H)=LN

4) Resolution R (분리도)

Rs=∆tW=2∆tWA+WB

- 혼합시료가 순수하게 분리된 정도를 분석하는 것이므로, 미지시료에 대해서만 분석하면 된다.

6) 미지시료 구성과 농도 구하기

- sample에 포함되어 있는 시료의 부피

30μL×4×10-64×10-6+10×10-3=0.011995⋯≈0.01200μL

- ‘미지시료에 포함되어 있는 부피 : 면적 = sample에 포함되어 있는 시료의 부피 : 면적’을 계산하여 미지시료에 포함되어 있는 B, T, X의 양을 결정짓는다.

- 시료의 양이 적으므로 아세트아마이드 : 증류수 = 6 : 4의 평균 밀도를 이용해서 각 시료의 질량비를 계산한다. (모두 약분되므로 부피비의 비율을 이용해도 무방하다.)

Ⅶ. Discussion

1. RT 해석

RT는 크로마토그래피 중 처음으로 시료가 검출이 되는 데 걸리는 시간을 의미한다. 이는 RT를 알면 컬럼에서 시료가 이동하는 속도를 비교해볼 수 있다. 표 3에서 B, T, X순으로 RT가 더 빠른 것을 확인할 수 있다. B를 기준으로 T와 X는 각각 메틸기가 1개, 2개가 치환되어 있는 형태이므로 분자의 크기가 커질수록 이동상에서 시료가 더 움직이기 힘들다는 결과를 알 수 있다. 다만, 그림 9에서 X는 같은 물질임에도 불구하고 3개의 peak가 관찰된다. 이는 X가 T를 기준으로 메틸기가 붙은 자리에 따른 이성질체가 존재할 수 있기 때문이다.

각 peak와 xylene을 대응하려면 HPLC의 이동상과 고정상에 대해 살펴보아야 한다. HPLC는 무극성의 고정상을 사용하며, (물+아세트아마이드)인 극성인 이동상을 사용하기 때문에 역상크로마토그래피라고 할 수 있다. 그렇기에 극성이 큰 물질일수록 이동상과의 상호작용이 고정상보다 증가하기 때문에 빨리 검출된다. X의 이성질체 중 메틸기가 서로 대칭으로 있는 p-xylene이 가장 작은 극성을 가지며, o-xylene은 가장 큰 극성을 갖는다. 따라서 그림 9에서 보이는 3개의 peak는 빨리 검출되는 순서대로 p-xylene, m-xylene, o-xylene이며, RT는 o-xylene을 기준으로 측정한 것임을 확인할 수 있다. 한편 B, T, X의 검출속도와 X의 이성질체의 검출 속도를 통해서 분자의 크기와 극성여부가 검출 속도에 영향을 주는 정도를 비교할 수 있다. 극성은 B, T, X순서로 증가하는데, 분자의 크기도 같은 순서대로 증가한다. 하지만 가장 무극성을 띠며 크기가 작은 B가 제일 빨리 검출이 되는 것으로부터 분자의 크기가 분자내 극성여부보다 더 주요한 영향을 미치는 것을 알 수 있다.

한편, RT의 상대적인 비교로 미지시료를 구성하고 있는 표준 시료들을 결정해야 미지시료가 포함하고 있는 물질의 조성을 구할 수 있다. 미지시료가 표준시료들의 혼합물이라는 것을 생각했을 때 mixture이기 때문에 상호작용을 감안하더라도 RT의 값이 비슷하게나마 관측이 되어야 하며 비교 결과 미지시료 1은 B, X 미지시료 2는 B, T로 구성되어 있는 것을 알 수 있었다. 그리고 peak의 면적 사이의 비율을 이용하면 실제 포함되어 있는 시료들의 부피를 구할 수 있다. 면적을 구성하는 정보는 시간과 전위차다. 같은 물질에 대해서 발견되는 전위차는 거의 유사할 것이므로 peak의 길이가 물질의 양을 결정지을 수 있다. 이에 실험에서 사용한 sample의 부피와 이동상과 표준시료 사이의 부피비를 고려하여 표준 시료의 부피와 그에 따라 관측되는 면적의 비를 구해서 물질의 양을 결정지었다. 부피는 온도, 압력 등에 의해서 영향을 많이 받기에 이를 solvent dry basis를 기준으로 미지시료의 질량 조성을 표현할 수 있었다.

2) 용량인자 분석

용량인자는 분석 sample이 구성하고 있는 각 성분이 column에서 머무는 정도를 표현한 것이다. 표 6에 해당 결과를 정리했으며 B, T, X 순서대로 용량인자가 증가하는 것을 확인할 수 있다, 이는 RT에서 설명했던 것과 같이 분자의 크기가 증가할수록 이동하는 정도가 감소하여 column에 더 오래 머무를 수 있기 때문이다. 용량인자는 peak의 위치 뿐만 아니라 실제 정량적인 계산을 통해서 구할 수 있다. 이는 이동상이 이동하여 peak가 관찰되는 시간과 그 후로 시료가 검출되기까지 걸린 시간의 비율을 구하면 된다. 제공받은 자료에서는 시료에 대한 시간만 나와있어서 이동상의 peak가 나타나기까지 걸린 시간을 따로 구할 필요가 있었다. 제공받은 그림을 geogbra에 옮겨 시작점, 이동상 검출 시점, 시료 검출 시점 사이의 비율을 구한 후 시작점과 시료 검출 시점에 대해 비율을 갖는 이동상의 검출 시점을 구할 수 있었다. 이론상으로는 같은 실험 환경에서는 이동상의 검출 시간은 동일해야 한다. 하지만, 실제 구해본 결과 이동상의 검출 시간에는 약간의 오차가 있었다. 이는 순수한 이동상이 이동하는 것이 아는 혼합물이 column을 따라 이동하기 때문이다. 그리고 기기가 실험 환경을 잘 조성했을 것이지만, 약간의 설정 오차가 발생하여 검출 시 차이가 발생했을 수 있다. 그리고 용량인자의 값을 통해서 용출의 적합성을 판단할 수 있다. 표 6을 확인해보면, 용량인자 중 가장 작음 값이 2.7050으로 이 수치는 1보다 크다. 그러므로 모든 시료가 적절하게 용출이 되었다고 판단할 수 있었다.

3) 선택성 분석

선택성은 mixture인 경우 peak가 얼마나 잘 분리되었는가를 비교하는 것이다. 이는 두개 이상의 peak가 갖는 용량인자의 비율을 계산해서 얻을 수 있다. 이번 실험에서 살펴봐야 할 mixture은 미지시료와 표준시료 중 X이다. 우선, 미지시료를 판단하기 위하여 표준시료 사이의 선택성과 실제 미지시료 사이의 선택성을 구하고 이를 표 7에 정리했다. 이상적인 mixture이라면 표준 시료 사이의 비율과 실제 미지시료의 비율은 동일해야 한다. 하지만 실제 측정 결과 그렇지 못했다. (애초에 표준 시료에 대한 정보들의 측정이 정확하지 못할 수 있지만 해당 가능성을 배제하고 설명하겠다.) 해당 현상을 설명할 수 있는 것은 사용한 sample이 실제로는 ideal solution이 아니라는 것이다. B, T, X 모두 탄화수소이므로 무극성 전자구름을 갖는 영역이 존재하여 시료 사이의 상호작용이 존재한다. 이는 표준 시료만 있을 때와 달리 상호작용으로 용출 시간이 영향을 받을 수 있다. 부수적인 이유로는 크로마토그래피 running 환경에 약간씩 차이가 났다는 점을 들어볼 수 있다. 그리고 X의 peak에 대해 살펴보자. 실제 선택성을 계산을 하지는 않았으나 그림 9를 보면 비교적 peak가 겹쳐져서 나타나는 것을 확인할 수 있다. 이는 이성질체가 서로 상호작용을 통해서 하나의 X 처럼 거동을 했기 때문이다. 정제 방법 등을 사용해서 한 가지 X를 사용하거나 분리도를 더 좋게 실험 환경을 설정하면 보다 나은 실험 결과를 얻을 수 있을 것이다.

4) 이론 단수 (N)와 이론단 높이 (H) 분석 + 더 높은 효율의 크로마토그래피 running 방법

이론 단수와 이론단 높이는 컬럼의 효율을 보여주는 대표적인 지표이다. 이론단수와 이론단높이는 식을 통해서 계산할 수도 있으나 실험 결과에 해당 지표가 표현되어 있었기 때문에 이론 단수는 직접 계산하지 않았다. 그리고 기기의 정보를 통해 사용한 column의 길이를 이용해서 H를 계산할 수 있었다. 이동상의 유속, 온도, 시료 주입 조건 등 실험 환경이 동일하다면 해당 값은 거의 변하지 않아야 한다. 표 8에 정리된 정보를 보면, 표준 시료 형태일 때의 N과 미지시료를 구성하는 각 성분일 때의 N이 차이를 보이는 것을 확인할 수 있다. 해당 원인을 Van Deemter Equation을 통해서 살펴보자.

HETP=A+B/μ+Cμ

이동상의 속도 μ 가 일정하다고 했을 때 소용돌이 확산 정도 A, 이동상에 시료가 확산되는 정도 B, 물질 전달 정도 C를 통해서 생각해볼 수 있다. 우선 같은 이동상과 고정상을 사용하므로 A에 대한 차이는 거의 발생하지 못한다. B는 peak의 높이를 나타내는데, 해당 결과 데이터를 보면 표준 시료들과 미지시료에서의 height에서는 거의 차이가 발생하지 않음을 확인할 수 있다. 즉 미지시료에서 C의 차이가 발생했기 때문에 값의 차이가 발생했다고 할 수 있다. C는 시료가 이동상 - 정지상 사이에서 이동할 수 있는 정도를 뜻하는데, mixture인 경우 해당 상호작용에 영향을 받을 수 밖에 없다. 다만 실험을 1번만 진행했기 때문에 N의 증감 경향성이 들쑥날쑥하며, 정확한 경향성은 확인할 수 없었다.

한편, N의 값을 조정함으로써 column의 효율을 증가시킬 수 있다. 첫 번째로 column의 길이를 증가시켜서 시료 사이의 분리가 더 잘 진행되도록 한다. 하지만 column의 길이를 가하는 압력, 이동상의 속도가 수용하지 못할 정도로 증가시킨다면 이동상에 시료가 필연적으로 혼합되기 되기 때문에 pure한 이동상을 사용하지 못하게 되며 되려 분리 효율을 떨어트릴 수 있다. (mixture의 entropy에 대해서 두 물질의 극성이 다르더라도 소량에 대해서는 무조건 혼합이 가능하기 때문이다.) 그리고 column을 채우고 있는 입자의 크기를 줄여서 더 균일하고 표면적이 증가한 상황에서 running을 진행하면 효율이 증가한다. 또한 이동상의 온도를 높이고, 점도를 낮추어서 효율을 높일 수 있다. 그리고 기기상의 문제가 아닌 실험자가 지나치게 크거나 분자구조가 긴 sample을 running하지 않아 자체적으로 더 높은 분리 효율을 얻을 수 있다. 그리고 시료를 넣을 때 공기가 유입되지 않도록 해야 한다. 이는 같이 주입된 공기에 포함되어 있는 물질 등이 농도에 영향을 줄 수 있으며 심지어 불필요한 peak를 얻어내는 데에도 영향을 주기 때문이다. 그리고 running 도중 압력을 일정하게 유지시켜 마찬가지로 압력차에 의해서 발생하는 불필요한 peak가 발생하지 않도록 조정할 수 있다.

5) 분리도 분석

결국 크로마토그래피는 미지 시료를 분석하고 정량적 수치를 얻어내고자 하는 정제과정이기 때문에 효율은 혼합물들을 잘 분리하는 지표를 나타내는 분리도와 직결된다. 분리도는 앞서 구한 용량인자. 선택성, 이론단수를 이용해서 구할 수 있으나. mixture에 대해서 해당 수치들의 기준을 잡는 것이 애매하다. 이에 혼합물을 구성하고 있는 peak 너비의 평균과 구성하고 있는 시료들이 각각 분리될 때 까지 걸리는 시간 사이의 비율을 이용해서 분리도를 구할 수 있다. 그림 6에서 분리도의 수치에 따른 peak의 분리 정도를 확인할 수 있다. 이번 실험 결과 미지시료 1과 2의 분리도는 각각 8, 12이상이므로 분리가 잘 되었다고 판단하는 기준값인 1.5보다 매우 큰 것을 확인할 수 있다. 즉, 분리가 잘 되었다는 것으로 판단이 가능하다. 하지만 표준시료 X의 분석 결과를 보면 peak가 완전히 분리되지 못한 것을 확인할 수 있다. 만약 해당 peak들에 대해서 분리도를 계산하면 1.5보다는 작은 값들을 얻을 수 있다고 예상 가능하다.  

Ⅶ. Reference

1. 서강대학교 화공생명공학기초실험1 매뉴얼 2020

2. 오도석, CHROMATOGRAPHY 1st reviced edition, 학술편수관, 2012. pp. 13~15, 82~85

Ⅰ. Title

염색체 DNA의 정제 및 분석

Ⅱ. Purpose

1. 대장균에서 염색체 DNA를 분리, 정제하는 과정에서 시약과 효소의 작용 이해

2. PCR과 전기영동의 사용방법 및 원리 익히기

Ⅲ. Theory

1. 유전물질의 구조

세포를 이용해서 실험을 하는 경우, 다루기 쉬우며 배양이 쉬운 세포를 사용한다. 효모, 예쁜꼬마선충(caenorhabitis elegans) 등을 많이 사용하지만, 대장균 (E. coli)이 많이 사용된다. 이와 같은 세균에는 염색체 DNA(Bacterial DNA)와 plasmid를 갖고 있다. 따라서 해당 세포의 유전자를 실험에서 사용한다면, Bacterial DNA와 plasmid를 구분해야 한다.

1) Bacterial DNA - 뉴클레오타이드와 DNA의 구조와 특성

세포 속에는 유전 물질이 저장되어 있다. 그 중에서 DNA는 핵산의 한 종류로 인산, 당 그리고 염기(base)로 구성된 뉴클레오타이드(nucleotide)의 복합체이다. DNA 구조를 이해하기 위해서 뉴클레오타이드의 구조를 살펴봐야 한다.

뉴클레오타이드의 구조는 다음과 같다. 뉴클레오타이드는 인산과 당 그리고 염기가 각각 1:1:1로 구성되어 있다. 우선, 당은 탄소 5개로 구성된 5탄당이다. 당의 탄소는 산소를 기준으로 시계방향으로 순서를 매겨, 3번 탄소에 수산화기가 연결되며, 5번 탄소에 인산이 연결된다. DNA를 구성하는 당은 디옥시리보오스다. 또한, 인산은 DNA를 구성할 때 공유결합을 통해 외부 골격을 형성한다. 이 과정에서 인산은 수소원자를 내어놓기 때문에 전기적으로 (-) 부호를 띤다. 마지막으로 염기의 종류로는 사이토신(C), 구아닌(G), 아데닌(A) 그리고 티민(T)이 있다.

NA는 염기 사이의 수소결합과 인산-디옥시리보오스 공유 결합을 통해서 DNA 구조를 형성한다. 염기는 상보적 수소 결합으로 서로 결합을 한다. 아데닌과 티민은 2개의 수소결합을 통해서 퓨린계를 형성한다. 구아닌과 사이토신은 3개의 수소결합을 하며, 피리미딘계를 형성한다. 그리고 인산과 당의 결합 구조는 탄소의 번호를 이용해서 설명한다. 인산에서 수소가 분리되어 3번 탄소와 연결된다. 인산과 당의 결합으로 형성된 외부 골격을 5번 탄소에서 시작하여, 3번 탄소에서 끝난다고 말한다.

편, DNA는 구조에 따라서 3가지 DNA로 구분할 수 있다. 왼쪽의 그림에서 왼쪽부터 차례대로 A-DNA, B-DNA, 그리고 Z-DNA이다. 우리에게 익숙한 DNA는 가운데의 B-DNA이며 10 bp를 갖는다. 다만, A-DNA는 나선의 기울기가 30°가량 기울어져 있으며, B형보다 더 회전 정도가 심해 한 나선에 11 bp를 갖는다. Z형은 B형과 거울상 대칭을 보이며 12bp를 갖는다.

2) 플라스미드(plasmid)의 구조와 특성

plasmid는 고리 형태를 보이는 유전물질이며, bacterial DNA와는 다르게 스스로 복제할 수 있다. 일반적으로 plasmid는 supercoiled form으로 존재한다. 이는 plasmid가 두 가닥으로 구성이 되어 있다. 정제 등 plasmid에 외부 요인이 관여한다면 3가지 형태를 가질 수 있다.

외적 요인의 존재에도 불구하고 변형이 가해지지 않을 때에는 supercoiled DNA, 두 가닥 중 한 가닥이 잘릴 때 관찰되는 open-circular DNA (Nicked DNA), 그리고 두 가닥이 모두 끊여졌을 때에는 liner DNA 형태가 관찰된다.

2. DNA의 분리

박테리아는 크기가 작으며, 그 구조가 단순하다. 특히 원핵세포의 경우 핵이 따로 존재하지 않기 때문에 세포의 내부와 외부를 구분하기 위해서 세포막과 세포벽이 있다. 다만, 이러한 형태로 존재하는 경우 세포 내부에 존재하는 물질을 이용하고 분석하기 쉽지 않아서 DNA 분리 과정을 거쳐야 한다. DNA 분리는 세포벽과 세포막을 분해하여 유전물질을 얻어내는 것이다. 세포벽은 그램양성균또는 그램음성균으로 구성되어 있으며, 세포막은 인지질과 단백질 등으로 구성이 되어있다. 다양한 방법이 존재할 수 있으나 Alkaline lysis 방법을 많이 사용한다. Alkaline lysis 방법은 높은 pH를 알칼리성 음이온 계면활성제 용액을 이용해서 대장균 세포를 용해시킨 후 원심분리 방법을 이용해서 plasmid DNA와 bacterial DNA (염색체 DNA)를 구분할 수 있게 된다.

(1) 단계는 주어진 박테리아의 세포벽을 분리하는 단계이다. 이를 위해서 이온성 계면활성제 EDTA와 효소 lysozyme을 사용한다. EDTA는 마그네슘 이온과 칼슘 이온과 같은 2가 양이온들과 chelating 하는 성격을 갖고 있다, 세포벽에는 칼슘 이온이 있으며, 이온은 세포벽이 잘 유지될 수 있도록 한다. EDTA를 이용하면 세포벽 사이의 칼슘 이온이 분리되어 박테리아가 잘 분해될 수 있도록 한다. 한편, 원핵세포의 세포벽은 펩티도글리칸(peptidoglycan)으로 구성되어 있으며, 이 당은 1,4-glucosidic linkage로 구성이 되어 있다. lysozyme은 1,4-glucosidic linkage를 분해하여 세포를 용해되도록 한다. (1) 과정에서 넣어주는 sucrose는 분해하고자 하는 세포와 EDTA + lysozyme 등으로 구성된 용액 사이의 삼투압을 유지하는 용도로 이용된다. 생체물질은 pH에 민감하여 변성이 쉽게 발생한다. (2) 단계에서는 NaOH 등 강염기를 혼합하여 Bacterial DNA와 plasmid의 변성을 일으킨다, 이 과정에서 Bacterial DNA는 구조의 크기가 커 변성이 많이 발생하며, plasmid는 이보다는 변성이 적게 일어난다. 또한, Triton X-100 계면활성제를 이용하여 인지질의 소수성 부분을 녹이고 단백질은 변형시켜 세포막을 용해한다. (3) 단계에서는 (2) 단계를 거쳐 pH가 매우 높은 염기성 상태의 용액을 다시 중성상태로 만든다. 이 과정에서 plasmid는 변성정도가 적어 원래의 형태로 돌아올 수 있으나 Bacterial DNA는 그렇지 못한다. 따라서 분획을 이용하면 plasmid와 세포 찌꺼기, 변성된 단백질 등과 얽힌 변성된 bacterial DNA가 분리된다.

3. PCR (Polymerase Chain Reaction)

일반적으로 생물 내에서의 메커니즘 만을 이용하여 분석하고자 하는 유전 물질을 얻어내려면 시간 이 오래 걸린다. (in vivo) 하지만 세포 밖에서 체내에서 유전 물질은 복제하는 메커니즘을 모방하는 방식을 이용한다면 비교적 빠른 시간 내에 분석하고자 하는 물질을 얻어낼 수 있다. (in vitro) 이 방법을 PCR (Polymerase Chain Reaction, 중합효소연쇄반응) 이라고 한다.

1) 구성 요소

PCR을 진행하기 위해서 복제하고자 하는 물질과 함께 아래의 4가지 물질을 같이 넣고 복제를 진행해야 한다.

① DNA Template

DNA Template는 실험에서 사용하고자 하는 부분을 말한다. 즉, PCR cycle을 통해서 증폭하고자 하는 표적 염기서열을 말한다. 앞서 살펴보았듯이 Bacterial-DNA는 이중 나선 구조를 보이며 염기 A와 T, G와 C가 각각 수소 결합을 통해서 상보적인 염기서열을 갖고 있다. 한편, 방향성에 따라 anti-parallel한 결합을 보이기도 한다.

② Primer

생체 DNA를 복제하는 과정 중 primer가 붙어야만 복제가 시작된다. 즉, primer의 부착은 복제의 시작을 말하며 복제하고자 하는 부위를 결정한다. 또한 DNA 구조에서 인산기의 수산화기와 디옥시리보스의 3번 탄소와 연결이 되어 있기 때문에 복제 과정에서도 해당 결합을 필요로 한다. DNA polymerase도 마찬가지로 중합을 진행할 때 3번 탄소에 -OH를 제공해야 하기 때문에 primer는 필수적이다. primer의 길이는 다양하나 복제하고자 하는 DNA에 따라 적당한 길이를 설정해야 한다.

③ DNA Polymerase

중합의 기본이 되는 template와 primer가 결합하면 DNA polymerase가 중합반응을 진행할 수 있다. 이 효소는 뉴클레오타이드를 연결하여 DNA를 복제한다. 복제의 방향은 DNA template에서 3번 쪽에서 5번 쪽으로 진행한다. 이는 상보적 결합에 의하여 primer의 5번 탄소에서부터 결합을 시작하기 때문이다. DNA polymerase의 종류는 많으나, PCR은 비교적 고온에서 진행되는 경우가 많다. 그래서 뜨거운 온천에서 생존하는 세균 Thermus aquaticus으로부터 얻은 Taq polymerase를 많이 이용한다.

④ Nucleotide

DNA polymerase가 DNA를 연장하려면 결합에 필요한 뉴클레오타이드가 필요하다. template의 염기 서열과 상보적으로 결합이 진행된다.

2) PCR cycle

PCR 메커니즘은 온도 정보의 변화를 따라 3단계로 구분된다.

① DNA 변성 (Denaturation)

이 과정은 target DNA (gene of interest)를 포함한 DNA를 고온으로 가열하는 과정이다. 단백질 등에 고온이 가해지면 변성이 올 수 있는데, DNA도 마찬가지로 변성이 진행된다. 고온 상황에서는 DNA의 수소결합이 더 이상 형태를 유지하지 못하고 끊어진다. 이 과정을 통해 이중 나선 구조(dsDNA)를 보이던 DNA가 단일 가닥 형태(ssDNA)로 벌려진다. 높은 온도일수록 denaturation이 잘 일어나지만, DNA polymerase 등 다른 물질도 변성이 진행될 수 있어 적당한 90℃ 정도에서 진행한다.

② 프라이머의 결합 (Annealing)

DNA polymerase가 중합반응을 진행하려면 primer가 변성이 일어난 template DNA에 붙어야 하기 때문에 온도를 어느정도 낮추어야 한다. 온도를 많이 낮추면 염기들이 상보적으로 결합하지 못하고 이상한 결합이 발생할 수 있기 때문에 결합에 적당한 온도를 찾아야 한다. 이 온도는 프라이머에 포함되어 있는 염기의 개수에 의해 결정된다. 프라이머의 길이에 따라서 Annealing 과정에서 설정되어야 하는 적당한 온도는 아래와 같이 구할 수 있다.

다만, 이 식은 다양한 환경 요인(중합효소의 종류, 농도 등)의 영향력 아래에 있기 때문에 각 상황에 맞는 을 계산해주는 프로그램을 이용하는 경우가 많다. 한편, 구한 보다 약간 더 낮은 온도에서 Annealing을 진행하면 더 결합이 잘된다.

③ DNA 합성 (Elongation)

DNA polymerase를 이용해서 DNA를 복제하는 과정이다. 프라이머를 기준으로 5번 탄소에서 3번 탄소 방향으로 합성이 진행된다, 이때에는 template를 기준으로 상보적인 염기 서열을 가진 DNA가 복제가 된다.

해당 cycle을 반복적으로 진행하면 우리가 얻고자 하는 DNA 물질을 많이 복제할 수 있다. 다만 생성된 물질은 바로 사용하지 못하며, 정제 과정을 거쳐야 사용할 수 있다.

4. 전기영동

전기영동을 이용하면 생체 고분자의 특성을 분석하고 정제할 수 있다. 전기영동은 전기장에 걸려있는 분석 및 정제하고자 하는 물질이 전하를 띨 수 있는 성질을 이용한다. 특히 DNA는 인산-당 결합으로 구성된 외부 골격이 (-)를 전하를 띠기 때문에 분석에 용이하다.

1) 이동 속도 결정

전기 영동에서 DNA들은 몇 가지 특성에 의하여 이동하는 속도와 거리가 결정된다. DNA의 net charge, DNA의 크기 및 모양, 전기장의 세기, supporting meduium의 성질, 그리고 전기영동이 진행되는 온도에 의하여 결정된다. 분석되는 물질을 구형이라고 가정하고 나비에-스토크스 방정식을 이용하면 아래와 같은 식을 얻을 수 있다.

(두 전극의 전위차: E, 전극 사이의 거리 d, 분자의 전하 q, 용액의 점성도: , 반지름: , 물질이 움직이는 속도: )

한 번의 전기 영동을 실시하면 sample들은 같은 시간동안 분석이 되므로 이동 속도가 더 빠르면 더 많은 거리를 이동한다고 생각할 수 있다.

전극 사이의 전압과 물질의 전하와 더 많은 거리를 이동할 수 있다. 반면, 물질의 크기가 클수록 (즉, 물질의 부피가 클수록), buffer의 점성도가 클수록, 두 전극 사이의 거리가 클수록 물질은 더 적은 거리를 이동한다. 또한, 전기영동이 시행되는 온도가 높을수록 더 빠르게 이동할 수 있으나, 너무 높은 온도는 분석 물질의 변형을 유발할 수 있으므로 주의해야 한다.

한편, 전기영동을 진행할 때 물체의 속도가 무한하게 증가하지는 않는다. 전하를 띤 입자는 supporting medium을 통해 이동할 때 마찰력에 의해서 진행방향과 반대 방향으로 영향을 받기 때문이다.

2) 아가로오스 겔 전기영동 (Agarose gel Electrophoresis)

전기영동에는 다양한 종류가 있으나 agarose gel 전기영동에 대해서 자세히 살펴보도록 하자.

agarose는 D-galctos와 3,6-anhydro L-galactose가 결합되어 형성된 중합체다. 이 물질의 구조에서 보이는 구멍의 크기는 일정하지 않다. 그래서 분리 시 해상도가 좋은 편은 아니나, 넓은 범위의 bp 길이를 갖는 DNA 들을 분리해낼 수 있으며 다루기 쉽기 때문에 맣이 사용되는 전기영동법이다. agarose가 gel 형태로 만들어져 있지 않다면 전기영동시 사용할 buffer에 녹여서 gel 형태로 굳혀 사용하며 그렇지 않은 경우에는 제조된 gel의 구성에 따라 buffer를 사용하는 것이 좋다.

ⅰ) agarose gel 전기영동에서의 이동 속도에 영향을 주는 요인

(ㄱ) gel 사이의 구멍을 통과해야 DNA가 이동할 수 있다. 그렇기에 크기가 비교적 작은 크기의 DNA가 더 많이 움직일 수 있다.

(ㄴ) agarose gel의 농도에 따라서 분리할 수 있는 DNA의 크기가 달라진다.

(ㄷ) 비슷한 분자량의 DNA를 분리하더라도 분리하는 DNA의 형태에 따라서 이동하는 속도가 달라질 수 있다. 앞서 살펴보았던 plasmid는 supercoiled circular, nicked circular, linear형태로 존재할 수 있다. buffer로 EtBr을 사용하는 경우 일반적으로 supercoiled circular plasmid가 다른 plasmid보다 빨리 움직일 수 있다.

(ㄹ) buffer의 이온강도에 의해서도 물질의 이동이 영향을 받는다. 이온 강도는 용액 안에 들어있는 이온 농도를 표현하는 수치인데, 이 값이 작으면 DNA 이동 속도가 매우 느리다. 그러나 지나치게 이온 강도가 센 용액을 사용하면 전류 때문에 고온이 발생할 수 있으며 이는 시료의 변성을 유도하고 gel을 녹일 수 있기 때문에 주의해야 한다.

ⅱ) buffer

agarose gel 전기영동을 진행할 때 2가지 종류의 buffer를 이용한다. 각 buffer의 조성과 특징을 아래의 표로 정리했다.

한편, polyacrylamide gel을 이용한 전기영동도 널리 이용된다. agarose gel보다 gel의 합성이 어려우나, 더 많은 양의 시료를 더 뚜렷하게 정제할 수 있다는 장점이 존재한다.

ⅲ) Gel staining dye

일반적이 DNA의 색은 무색으로, 이를 관찰하라면 또 다른 처리가 필요하다. 이를 위해 사용하는 것을 Gel Staining Dye라고 한다. 이 물질들은 염기 사이의 수소 결합에 작용한다. 처리 후 자외선을 이용하면 형광 정도가 기존보다 더 증가해서 관찰이 용이하다. 대표적인 예시로는 EtBr이 있다. 다만, 이 물질은 독성이며 DNA에 직접적인 영향을 줄 수 있어 RedSafe 등 다른 시료로 대체하여 사용 가능하다.

Ⅳ. Procedure

1. PCR

- E coli(대장균)의 gDNA에서 gldA(1104bp), mgsA(459bp) 유전자를 증폭

1) PCR premix tube에 gldA, mgsA를 추출할 각각의 시약 넣기

- Rnase free water (14μL) + E coli (2μL) + gldA upstream primer (2μL)

                                                                                             + gldA downstream primer (2μL)

- Rnase free water (14μL) + E coli (2μL) + mgsA upstream primer (2μL)

                                                                                             + mgsA downstream primer (2μL)

-> 2개의 tube 만들기

2) PCR 기계에 tube를 꽂은 뒤 온도와 cycle을 설정하여 작동

표  SEQ 표 \* ARABIC 3 PCR cycle에서 필요한 온도와 실행 주기 횟수

한편, 온도를 gradient로 설정하여 왼쪽 5칸에 mgsA, 오른쪽 4칸에 gldA를 두기

2. 전기영동

- 증폭된 DNA를 분리하여 확인

1) Agarose gel을 전기영동기에 놓기

2) TAE buffer를 전기영동기에 gel이 잠길 정도로 붓기

3) 홈에 DNA ladder 10μL씩 홈에 각각 주입

4) 2개의 PCR product를 10μL

5) 100V로 30분 동안 전압 걸기

6) 전기영동기를 끄고 Agarose gel을 UV-VIS에 올려 band를 확인

Ⅴ. Data & Result

1. DNA ladder와의 비교를 통한 gldA와 mgsA의 bp 측정값 및 오차율

- 단순히 육안을 통한 비교가 아닌 geogbra 프로그램에서 y 좌표를 표현한 후, 가장 인접한 두 DNA ladder와의 내분 정도를 비교하여 최대한 구체적인 수치를 얻으려고 했다.

- 위에서 구한 수치들과 이론 전개 정도와 비교한 정도를 아래의 표 2에 정리하였다.

Ⅵ. Discussion

PCR 과정은 분석하고자 하는 DNA sample의 중 특정 DNA의 양을 최대한 극대화하여 후에 분석 시 정확도와 관찰 정도를 증대하는데 도움이 되는 과정이다. PCR 과정은 denaturation - annealing - polymerization 과정을 따르고 일반적으로는 DNA template, primer, DNA polymerase, nucleotide를 넣어주었다. 다만 이번실험에서는 조금 다른 점이 있다. E coli를 바로 넣어주어 polymerase 등을 따로 넣는 점을 방지했다. 또한 이들을 섞기 위해서 Rnase free water를 넣어준다. 이는 가수분해효소가 없는 증류수를 의미하며, DNA와 효소 등이 분해되는 것을 방지하기 위함이다. 이번 실험에서 관찰되는 PCR cycle에 대해 살펴보자. 이번 실험에서는 gldA와 mgsA를 사용하는데, 이는 DNA이기 때문에 이중결합을 하고 있다. DNA 복제 과정에서 DNA는 효소에 의해서 단일 결합으로 잠시 분리된다. denaturation에서는 DNA가 고온에서 변성을 일으킨다는 특성을 이용해서 강제로 단일 결합 상태로 만든다. 이는 이중 결합을 유지하고 있던 수소 결합이 고온에서 끊어지기 때문에 가능하다. 다만 너무 높은 온도에서 진행하는 것은 E coli와 내부에 포함된 효소도 변성이 진행될 수 있기 때문에 98℃에서 진행했다. 두 번째로 annealing 단계를 진행했다. 이 단계는 넣어준 primer가 분리된 단일 가닥 DNA(ssDNA)에 부착되어 DNA 형성을 진행하는 단계이다. primer가 E coli 속의 DNA에 붙는 과정인데, 이 과정이 진행되려면 PCR 기기의 온도를 낮추어야 한다. primer와 ssDNA가 결합하는 것은 수소결합이 형성되는 것을 의미하기 때문이다. 온도가 낮을수록 수소 결합은 더 많이 형성될 것이나, 지나친 온도 저하는 undesired sample을 얻을 수 있기 때문에 각 primer마다 요구되는 annealing temperature Tm를 계산해야 한다. 계산 방법은 아래와 같다.

gldA와 mgsA의 upstream primer와 downstream primer의 염기서열과 요구되는 Tm을 아래의 표 3에 정리했다. 각 primer와 primer의 농도 가중치 정도를 반영하여 Tm을 결정할 수 있으며, 이 실험에서는 농도가 같은 시료를 사용하므로 Tmu와 Tmd의 평균값을 채택하면 된다.

위의 결과는 이상적인 Tm이며 실제로는 더 나은 결합을 위해서 해당 값에서 약간 차이가 나는 온도에서 annealing을 진행하며, gldA의 경우 55℃ mgsA의 경우 59℃으로 Tm으로 설정했다. annealing 과정을 여러 번 진행해서 복제된 DNA sample을 얻는데 cycle의 수와 product는 마냥 선형적인 관계는 아니기 때문에 너무 많이 진행하여 부산물이 생성되지 않도록 주의해야 한다. 마지막으로 결합된 primer를 기준으로 DNA 연장을 진행하여 우리가 얻고자 하는 gldA와 mgsA를 얻는다 이는 E coli 내부에 있는 DNA polymerase가 관여한다. 더 나은 PCR 기기는 T gradient를 각 cell마다 설정할 수 있으나 실험에서 사용한 PCR 기기는 그렇지 못해서 각 DNA를 얻기 위해서 2번 같은 과정을 반복해야 한다. PCR 과정에서 template나 primer의 양이 너무 적으면 DNA와 primer의 결합이 잘 진행되지 않아서 PCR 과정을 진행한다고 하더라도 얻고자 하는 DNA가 잘 얻어지지 않을 수 있다. 그리고 소량의 물질을 다루기 때문에 피펫을 잘못 사용하여 벽면에 각 물질이 붙어버리거나 하면 마찬가지로 얻고자 하는 sample을 잘 얻을 수 없기에 이 부분을 유념해야 한다. 마찬가지로 소량의 물질을 다루기에 각 물질들이 오염되지 않은 상태에서 진행하도록 해야 한다. 예를 들어 대기 중 수분 속에 포함되어 있을 수 있는 가수분해 효소는 시료를 분해할 수 있다. 한편, 온도는 관성이 큰 특성이기에 온도 변화를 즉각적으로 조정하기 힘들어서 각 과정에서 요구하는 온도까지 도달하는데 시간이 걸리고, 이는 부정확한 product를 얻는데 관여할 수 있다. PCR 과정을 통해 얻은 product가 맞는지 확인하기 위해서 단백질 분석을 진행하기도 하며, 얻고자 하는 물질의 종류들을 아는 경우 전기영동을 이용해서 종류 결정 과정을 간소화할 수 있다.

일반적인 전기영동 실험에서는 우리가 실험을 진행하는 환경에 맞추어 제작할 필요가 있으나, 이번 실험에서는 특별히 그 과정을 진행하지 않고 Safeshine Agarose Gel을 사용했다. agarose gel과 전기영동 시 이용하는 TAE buffer가 들어가는 것은 일반적인 agarose gel의 제법과 다른 점이 없다. 다만 gel 자체에 gel staining dye 역할을 수행하는 Safeshine Green이 포함되어 있어서 PCR product를 running sample로 이용할 때 gel staining dye를 추가해야 하는 번거로움을 덜 수 있었다. 이 과정에서 product의 양이 매우 작기 때문에 dye와 혼합을 진행할 때 시료가 벽면에 붙는 등 손실을 최소화하기도 한다. 이번 실험에서 분리하고자 하는 DNA gldA와 mgsA의 bp 길이가 각각 1104 bp와 459 bp이기 때문에 해당 크기의 DNA를 잘 분리할 수 있는 1% agarose gel을 사용했다. 아래의 표 4는 DNA size를 잘 분리할 수 있는 agarose gel을 표로 나타낸 것이다.

보다 DNA가 잘 이동할 수 있도록 TAE buffer를 사용했다. buffer는 pH의 범위를 일정하게 유지하도록 하는데, DNA가 pH 변화에 민감하다는 것을 고려하여 선정한 이동상이다. 실제로 running을 하면 DNA가 갖고 있는 (-) 전하 때문에 (+)극 쪽으로 이동을 할 수 있고, 이 이동의 driving force는 전기장에 걸린 전압이다. 정제를 마쳤다고 판단되면 UV-Vis 장치를 이용하여 전개정도를 비교한다. running 중 DNA의 수소결합에 관여한 safeshine green이 활성화되어 자외선을 발산하여 실제 전개된 정도를 비교할 수 있다.

다음으로 실험 결과를 살펴보자. 우선, UV-Vis 결과 DNA 끌림 현상이 관찰된다. DNA band 위 끌림 현상은 DNA의 농도가 높아 동시에 정제가 진행되지 못한 것을 의미하며, DNA band 아래 끌림 현상은 짧은 bp를 갖는 DNA 조각이 존재했기 때문에 관찰되는 현상이다. DNA 끌림이 발생했다고 판단되는 band는 mgsA이며 DNA band 아래 끌림이 관찰된 것으로 보아, PCR 과정 중 미처 결합을 하지 못한 DNA 조각이 있거나 전기영동 중 전기장에 영향으로 인해 일부 분해된 mgsA의 영향 때문일 수 있다. mgsA에 대해 DNA band 위 끌림도 관찰된 것으로 보이는 데, 실험 환경을 정확하게 알 수 없으나 사용한 agarose gel의 농도가 수용할 수 있는 분해 정도보다 더 높은 농도의 sample을 setting했거나 running 도중 safeshine green이 지나치게 관여하여 DNA 구조에 영향을 미쳤기 때문일 수도 있다. 한편, gldA에 대해서는 DNA 끌림은 관찰되지 않으나 100bp 부근에 미세한 band가 관찰된다. 이는 PCR 과정 중 미쳐 결합을 하지 못한 template가 running에 참여한 것으로 생각해볼 수 있다. 표 2를 살펴보자. 해당 표의 비고를 보면 두 DNA 모두 예상보다 전개가 덜 되었다고 판단된다. 이는 그림 1에서 DNA ladder를 봐도 알 수 있는데, 실제 전개된 DNA ladder에 비해서 DNA band들이 뚜렷한 간격을 유지하니 못하는 것으로부터 생각해볼 수 있다. 이 오차에 대한 대표적인 원인으로는 충분한 running 시간을 확보하지 못한 것이 있다.

PCR 증폭은 다양한 방면에서 사용되고 있는데, 대표적으로는 의학적 진단에 주로 사용된다. 종양 세포에 대해서 유전적으로 변화된 정도를 관찰하기도 하며 박테리아 및 바이러스 감염에도 사용된다. 최근 유행하고 있는 코로나 바이러스 진단 과정에서도 PCR 유전자 증폭 방법이 사용된다.

Ⅶ. Reference

1. 서강대학교 화공생명공학기초실험1 메뉴열 2020

2. 강호일, 전기영동 최신 프로토콜, 월드사이언스, 2006, pp. 14~18

Ⅳ. Procedure

1. KBr과 사용할 시료를 100:1의 비율로 혼합한 후 막자사발에서 갈아 미세한 가루로 만든다. 충분한 시간을 들여 갈아준다.

2. Pelletizing by Pelletizer

- 희석한 sample을 아래 pelletizer 바닥을 가릴 정도로 넣은 다음 힘으로 세게 5~8분 동안 압력을 걸어주어 pellet을 만든다

3. Sampling setting

- pellet을 back plate의 원에 위치하도록 놓고 고정한다. 이 sample을 FT-IR 시료실내의 sample holder의 고정판 홈에 끼워 놓고 뚜껑을 닫는다

4. Sample을 scan하고 나온 스펙트럼을 저장한다.

<주의사항>

1. 실험실 내 음식물 반입 금지

2. 실험 시 장갑 착용

3. 시약과 호흡기 사이의 거리 유지

4. 뒷정리

Ⅴ. Data & Result

1. IR spectrum & structure

2. Spectrum analysis

1) biphenol A

3500-3200 O-H alcohols & phenols

3100-3000 C-H aromatics

3000-2850 C-H alkanes

1680-1640 C=C alkene

1600-1585 C-C aromatics

1400~1500 C=C aromatic

1375~1450: CH3 methyl

1320-1000 C-O alcohol, carboxylic acid, ester, ether

900-690 C-H aromatics

650 이하 etc

2) benzoic acid

3500-3200 O-H alcohols & phenols

3100-3000 C-H aromatics

3000-2600 O-H alcohols & phenols

1760-1690 C=O carboxylic acid

1600-1585 C-C aromatics

1320-1000 C-O alcohols, carboxylic acid, esters, ethers

950-910 O-H carboxylic acid

900-690 C-H aromatics

650이하 etc

3) 미지시료

3500-3200 O-H alcohols & phenols

3400-3250 N-H 1° 2°amines, amides

2950-2850 C-H aromatics alkanes

2500-2300 O-H carboxylic acid

1700-1500 C=O ketone carboxylic acid

1300-1200 C-O

1300-1200 C-N amines

1200-1000 C-O alcohols, carboxylic acid, esters, ethers

900-690 C-H aromatics alkane

650 이하 etc

위의 미지시료를 통해서 아래의 2가지 구조를 생각해볼 수 있다.

Ⅵ. Discussion

FT-IR을 통해서 biphenol A와 benzoic acid를 분석해보고 이를 바탕으로 미지 시료의 구조를 추론해보았다. 이를 위해서 우선 baseline으로 사용할 KBr sample에 대한 IR부터 측정을 했다. KBr은 IR 실험 결과에 큰 영향을 미치지 않는데, 대부분의 자외선과 적외선을 투과하기 때문이다. 다만, 공기의 영향을 최대한 배제하기 위해서 압력을 가한 시료를 사용했다. 다만, KBr은 물을 잘 흡수하는 성질을 갖고 있기 때문에 공기중에 최대한 노출이 되지 않도록 주의해야 한다. 만약 KBr이 충분한 수분을 흡수했다면 IR spectrum에서 3000-3500부근에서 peak가 나타날 것이다. KBr background scan의 목적은 실험 환경을 IR로 측정하고 이를 분석하고자 하는 sample들에 보정을 해주는 역할을 한다. biphenyl A와 carboxylic acid를 분석해본 것을 바탕으로 미지시료의 구조를 추론할 수 있었다. 만약 탄소가 2개 이상이었다면 관찰된 aromatic peak를 이용해서 고리구조를 가지며 질소를 포함하고 있는 물질에 대해서 생각해보았을 것이다. 하지만 탄소의 개수가 하나였으므로 해당되지 않는다. 그리고 3500-300부근에서 발견된 넓은 peak를 보는 관점에 따라서 2가지 분자구조를 생각해볼 수 있다. 만약 해당 peak가 잘못된 KBr 처리로 수분이 포함되었는 상태로 측정을 했다면 시료에는 OH가 포함되지 않아야 하며, 요소로 생각해볼 수 있다. 하지만 시료에도 OH가 포함되었다고 생각을 해보면 아민과 카르복실산을 동시에 포함하며 탄소가 하나인 carbamic acid로 생각해볼 수 있었다. 이 두 구조 모두 packing이 잘 되어 분자상의 CO2가 분석에 관여하지 못했다는 것을 가정한 후 추론한 것이다.

최대한 정확한 결과를 얻고자 했지만 그럼에도 불구하고 다음가 같은 이유로 정확한 spectrum을 얻지 못했다. 우선 pellet을 만들 때 공기중의 산소, 수소, 이산화탄소 등을 제거하기 위해 압력을 가한다. 하지만 pressure를 손으로 가하기 때문에 완전히 공기가 제거되지 못했을 수 있으며 이는 추가적인 peak가 관찰되는데 영향을 줄 수 있다. 또한 시료를 가는데 사용하는 막사사발과 국자를 과정마다 세척을 하고 진행하고자 했다. 하지만 사발에 흠집이 많이 있었고, 해당 부분으로 시료가 손실이 되거나 기존에 축적되었던 물질이 묻어나올 수 있기 때문에 스펙트럼에 영향을 줄 수 있다. 그리고 peak의 정보들만 가지고 판단을 진행하는데, 실험자가 직접 예측을 하는 것이므로 미지시료가 정확하지 못할 수 있다. 그리고 KBr과 시료를 섞어서 사용하며 시료의 양이 매우 적으므로 만약 혼합물 추출 시 운이 나쁘다면 분석이 잘 이루어지지 않을 수 있다.

Ⅰ. Theory

Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FT-IR)

Ⅱ. Purpose

FT-IR의 작동 원리를 이해하고 solid 형태의 물질에 대한 시료 준비 방법과 그에 대한 실험결과를 분석하고자 한다.

1. 대표적인 작용기를 갖는 물질들의 FT-IR spectrum을 통해서 peak를 확인

2. 미지 시료의 spectrum 분석을 통해 어떤 구조의 물질일지 추측

Ⅲ. Theory

1. 전자기 스펙트럼의 특성과 에너지

전자기파는 파동이 갖는 에너지에 따라 달라진다. 전자기파의 에너지는 진동수에 의해 결정되고 다음 식이 성립한다.

또한 파동의 속력이 일정할 때 파동의 진동수와 파장은 반비례 관계에 놓인다. 빛과 같은 파동은 속력이 일정하기 때문에 진동수와 파장의 곱은 항상 일정하다. 이 관계를 식으로 표현할 수 있다.

두 식을 정리하면 진동수가 빠를수록, 파장이 짧을수록 에너지가 더 크다는 것을 알 수 있다. 적외선은 780nm~1000μm의 파장 범위를 보이며 비교적 긴 파장을 갖는다. 즉, 적외선은 비교적 낮은 에너지를 갖는다.

2. 분광학에서의 에너지 준위와 에너지 전이

분광학에서는 시료에 빛을 쏘며, 물질은 특정 파동을 흡수 및 방출할 수 있으므로 에너지 변화가 수반된다. 에너지는 양자화 되어있어 두 상태의 에너지 차이와 같은 에너지에 의해서만 전이가 진행된다. 어떤 분자의 전체 에너지는 다음과 같이 4가지 형태의 에너지의 합으로 표현된다.

다만, 분광학에서 시료는 고정되어 있기 때문에 회전 운동 에너지($E_{rot}$)와 병진운동 에너지($E_{trans}$)의 효과는 무시된다. 즉, 에너지의 변화는 전자에너지의 변화 혹은 진동 에너지의 변화에 의해서만 발생할 수 있다. 시료가 빛을 흡수하면 다음과 같이 에너지 전이가 발생할 수 있으며, 그 크기는 다음과 같다.

한편, 앞서 말했듯이 시료는 빛을 받으면 에너지 전이가 발생한다. UV-Vis 분광학에서 사용하는 광원은 높은 에너지를 갖고 있기 때문에 전자에너지 준위 수준에서의 전이가 발생할 수 있다. 하지만, FT-IR 분광학에서 사용하는 광원처럼 낮은 에너지를 갖고 있는 경우에는 전자 에너지를 변화시킬 수 없으며 진동에너지 혹은 회전에너지에만 변화를 줄 수 있다. 다만, 분광분석시 회전 운동의 변화는 거의 발생하지 않으므로 진동 에너지의 변화가 발생할 수 있다. 한편, 모든 진동에너지가 적외선을 흡수할 수 있는 것은 아니다. 진동 및 회전 에너지에 의해서 Dipole moment(D)가 변화하는 경우에만 적외선을 흡수할 수 있다. IR을 흡수할 수 있으면 이 물질은 IR active하다고 하며, 흡수하지 못하는 경우에는 IR inactive하다고 말한다. 예를 들면 극성 분자는 진동 및 회전에 의해서 거의 D가 변하므로 IR active하다. 반면, H2, O2, Cl2와 같은 무극성 분자들은 운동에 의해서 D가 거의 변하지 않으므로 IR inactive하다.

3. 분자 진동의 종류

분자는 온도에 관계없이 항상 진동운동을 할 수 있다. 다만, 결합의 길이가 변하는가, 결합의 각도가 변하는지에 2가지 기준에 따라 분류된다. 결합의 길이가 변하는 진동 운동을 Stretching vibration이라고 한다. 만약 결합의 길이가 대칭적으로 변한다면 Symmetric stretching이라고 하며, 그렇지 못한 경우에는 Asymmetric stretching이라고 한다. 또한 결합각이 변하는 진동 운동을 Bending vibration이라고 한다. 그 중에서도 각도의 변화가 한 평면 위에서 진행될 수도 있으며, 그렇지 않을 수도 있다. In plane일 때, 결합이 같은 방향으로 움직인다면 이를 rocking bending, 반대 방향으로 움직인다면 scissoring bending이라고 한다. 그리고 Out of plane일 때, 같은 방향으로 결합이 이동한다면 wagging bending, 반대 방향으로 움직인다면 twisting bending이라고 한다.

4. 화학결합에서의 hook’s law와 진동에너지의 전이

앞서 말했듯이 적외선 영역의 전자기파는 화합물의 전자를 들뜨게 하지 못하고 화합물들을 진동 및 수축하게 만들 수 있다. 분자에서의 진동 및 수축은 용수철에서의 진동 및 수축의 연장선이라고 생각할 수 있다. 이를 이용해서 진동에너지 전이 개념에 대해 이해하려면 몇가지 개념을 먼저 알아야 한다.

1) 용수철에서의 hook’s law

용수철에서 평형을 이루고 있을 때보다 만큼 변하면 이에 저항하는 탄성력이 발생한다. 이 힘의 크기는 다음 관계를 갖는다.

한편, 해당 평형 상태에 대해서 거리가 r만큼 변하면 다시 평형점으로 돌아오게 하려는 구심력이 존재하고, 이 힘은 아래의 관계를 갖는다.

이 system에서는 이며 이기 때문에 식을 정리할 수 있으며 각속력과 진동수 사이의 관계 를 이용하면 식을 정리할 수 있다.

2) reduced mass μ

물리계에서는 두 물체 사이의 상호작용에 대해서 논의하는 경우가 많다. 하지만, 두 물체에 대해서 동시에 고려를 하게 되면 어려움이 발생하기 때문에 한 물질에 대한 상대 물질의 거동성으로 물질을 표현할 수 있다. (질량 중심에 대해서 논의하는 것도 이와 비슷한 원리이다.) 이는 뉴턴의 제 2법칙 (힘과 가속도 사이의 관계) 및 뉴턴의 제 3법칙(작용-반작용)을 이용하면 구할 수 있으며, 이를 통해 나온 환산 질량 (reduced mass, )는 다음과 같다.

3) 양자화된 에너지

양자화학에서의 Born-Interpretation을 따르면, 파동함수는 확률로 해석된다. 그래서 파동함수와 그 함수의 conjugation을 곱한 함수는 정규분포 곡선을 따르며 적분이 가능해야 하고 그 값은 1이여야 한다. 또한 파동함수는 one to one 함수이며, 슈뢰딩거방정식의 해이다. 또한, Hermitian operator를 이용하면 파동 함수의 오목 볼록 여부를 결정할 수 있다. 한편, Hermitian operator는 eigenfunction으로 파동함수를 가지며, eigenvalue로 에너지 E를 갖는다. 이들을 고려하면 파동함수는 에너지 함수가 closed-boundary condition에 놓여있을 때 eigenvalue E에 의하여 에너지가 양자화된 형태로 존재할 수 있다. 이를 보고 에너지가 ‘양자화’되어 있다고 할 수 있다.  

4) 화학결합에서의 hook’s law

가장 고려하기 쉬운 분자인 HCl에 대해 논의해보자. 분자가 가장 안정한 상태에 놓일 때 갖는 화학 결합의 길이를 req 라고 하자. 하지만, 분자는 3에서 이야기했던 것처럼 진동운동을 할 수 있으며, 핵간 사이의 거리가 변할 수 있다. 이를 hook’s law에 적용하면 아래와 같이 힘과 탄성에 의한 위치 에너지를 표현할 수 있다.

한편, HCl은 원자 H와 Cl에 개입하는 힘이 F 가 유일하다고 하면, 이 system은 조화 진동자에 놓인다. 그렇기에 두 원자 사이의 상호작용으로 운동을 설명할 수 있는데, Cl의 크기 및 질량이 H에 비해 월등히 높기 때문에 Cl이 고정되어 있다고 생각하고 H의 상대적인 움직임에 대해 살펴보자.

분자가 조화진동자를 따를 때 진동수는 다음과 같이 표현할 수 있다.

위의 그림과 같이 Cl을 고정하고 H에 대한 움직임을 판단할 수 있으므로, 즉 Cl을 벽에 고정하고 벽에 둔 조화 진동자 모델로 해석하는 것이다.

한편, 적외선 분광 분석에서는 에너지의 척도로 파수(wave number)를 이용한다. 이 척도의 단위는 cm−1를 이용한다. 에너지와 진동수는 비례관계이기 때문에 식을 적절하게 변환하면 위의 식을 파수에 대해서 표현할 수 있다.

5) 조화진동자의 양자화된 에너지 준위

분자의 진동이 조화진동자를 따를 때 진동 양자수 v 를 이용하면 양자화된 에너지 준위를 표현할 수 있다.

그리고 적외선 분광 분석에서 사용되는 wave number의 단위로 변환하기 위해서 위의 식을 변환할 수 있다.

진동 양자수에 따라서 에너지들이 정의되며, 위의 그림에서 Harmonics 곡선을 따른다. 진동 양자수 v=0, 1, 2⋯  대입하면 εv=12νosc,  32νosc,  52νosc ⋯ 이다. 이를 통해서 2가지 중요한 사실을 발견할 수 있다. 첫 번째로 에너지가 가장 낮은 지점의 에너지가 0이 아니기 때문에 진동에 의한 에너지는 절대온도가 0K인 지점에서도 항상 관찰된다. 그리고 진동 에너지 준위의 차이는 νosc 로 일정하다. 따라서 한 분자에 계속해서 적외선을 비추었을 때 나타나는 흡수 스펙트럼의 wave number는 배수 관계를 갖는다. 하지만, 실제로는 분자들이 단순 조화 운동을 하지 않기 때문에 modeling 한 에너지함수를 따르지 않는다. 이 이유에 대해서 살펴보도록 하자.

6) 실제 분자에서의 진동 에너지 양자화 현상

위의 그림에서 나타나는 Morse 그래프는 조화진동자 모델을 이용한 위치에너지보다는 비교적 정확하게 분자 진동 에너지를 설명할 수 있다. 이처럼 이상적 모델과 실제 분자가 다른 에너지 경향성을 보이는 이유는 현실세계에서의 결합 거리가 갖는 의미를 살펴봐야 알 수 있다. 어떤 두 원자가 결합을 하기 위한 필요조건은 두 원자가 일정 거리 내로 다가와야 한다는 것이다. 즉, 원자 사이의 거리가 너무 멀어지면 그 분자는 결합을 유지하지 못하고 해리된다. 결합의 길이가 req 로 가장 안정할 때를 기준으로 해리될 때 필요한 에너지를 Deq 라고 한다. 진동의 비조화성을 이용하면 에너지를 구하는 모스 함수(Morse function)를 얻을 수 있다.

이 식에서 값은 분자의 종류에 따라서 달라지는 상수이다. 모스 함수로부터 마찬가지로 양자화된 에너지를 wave number의 단위로 표현할 수 있으며 그 에너지는 아래와 같다.

여기서 는 평형상태에서의 진동 wave number이며, 는 분자마다 보이는 비조화 상수이나, 일반적인 값은 0.01이다.

위의 그림을 다시 살펴보자. 모스 함수를 사용하더라도 에너지의 최솟값이 0보다 크다. 이를 따라서 해리될 때 에너지와 최저점의 에너지를 가질 때의 에너지 차이, 즉 실제로 분자가 해리하기 위해서 필요한 에너지를 새롭게 정의하고, 이를 라고 하자. 조화 진동자를 따르는 에너지 함수는 진동 양자수가 증가하더라도 그 에너지 간격이 일정했다. 하지만, Morse함수를 따르는 에너지 함수에서는 진동 양자수가 증가하면 진동 에너지 전이 간격이 짧아지는 것을 확인할 수 있다. 실제로 식에 진동 양자수를 대입해본 후 에너지 차이를 구해봐도 그 값이 감소하는 것을 알 수 있다. 원칙적으로는 큰 값의 진동 양자수를 넣을 때에는 비조화 상수를 뿐만 아니라  등 추가적인 상수들을 고려해야 한다. 다만, 우리는 낮은 진동 양자수를 가질 때의 에너지 현상을 관찰할 것이므로 만 이용해서 표현하도록 하겠다.

8) 실제 분자에서의 진동 에너지 전이와 흡광 정도의 예측

비조화 진동자에서 선택규칙(selection rule)을 따라 에너지 전이가 발생한다면 진동 양자수의 변화 정도는 정수를 따른다. (∆v=±1, ±2,  ±3⋯)  다만, time-dependent 슈뢰딩거 방정식을 풀어주면 이원자 분자는 전자기파에 의하여 진동 양자수의 변화량이 1인 지점까지의 전이가 가장 활발하게 일어나는 것을 알 수 있다. ∆v=±1인 지점에서 활발  그리고 ∆v 이 커질수록 선택규칙을 만족하는 진동 에너지 전이가 발생하더라도 흡광도가 현저히 떨어진다.

9) 기준 진동 방식과 IR spectrum에서의 peak 개수

우리가 실제로 IR을 이용해서 분석하고자 하는 물질은 유기물 등 3개 이상의 원자를 갖는 경우가 대부분이다. 이는 실제 IR을 사용해 spectrum을 얻으면 peak의 개수가 2개 이상일 수 있음을 시사한다. 다원자 분자는 3차원 상에 위치하며, 각 좌표는 한 원자에 대해서 하나의 자유도를 갖는다. 그렇기 때문에 분자를 구성하는 원자의 개수 n 에 대해서 분자가 보일 수 있는 운동의 종류는 3n 이다. 다만, 병진 운동 에너지와 회전 운동에 의한 자유도를 제외하면 기본 진동 방식에 따른 peak의 개수를 유추할 수 있다. 비선형 다원자 분자의 경우에는 기본 진동 방식이 3n-6 , 선형 다원자 분자는 3n-5 의 기본 진동 방식을 보인다고 해석한다.

5. Infrared Spectroscopy (IR-Spectroscopy)

Theory 1~4에서 이야기했던 내용을 기반으로 적외선 분광 분석을 설명할 수 있다. IR Spectroscopy는 중간영역의 적외선을 광원으로 하여 시료를 분석하는 분광 분석법을 말한다. 적외선 영역의 전자기파는 화합물들을 진동 및 수축하게 만들 수 있으며, 그 에너지 값은 어느 정도 정해져 있다. 그래서 IR 분광법은 어떤 분자가 갖고 있는 작용기를 파악하거나, 정보가 어느정도 제공이 되어 있을 때 분자 구조를 결정하기 위해서 사용한다. 또한 특정 영역의 wave number는 지문 영역이라고 하여 해당 영역에서 보이는 peak의 여부가 시료의 종류를 결정지을 수 있다.

1) 구성

일반적인 분광 분석기처럼 IR Spectroscopy도 광원->간섭계->시료->검출기 과정을 거쳐 정보가 처리된다.

FT-IR 분광 분석기는 빛을 두 갈래로 나누어 시료에 쏘아, 그 정도를 판단해서 interferogram을 얻는다. 그리고 Fast Fourier Transform(FFT)를 이용하여 optical path difference를 축으로 가졌던 그래프에서 우리가 분석하고자 했던 wavenumber를 갖는 흡수 스펙트럼을 얻을 수 있다. 그리고 단순히 한 번의 분석을 하는 것이 아니라, 우리가 얻게 되는 흡수 스펙트럼은 상대적인 값으로 주어진다. 이는 시료가 존재할 때 발생한 흡광도를 시료가 분석하고자 하는 시료가 없을 때의 비율을 얻는다. 빛, 공기중의 수증기 등 적외선에 흡수가 될 수 있는 가능성이 많기 때문이다.

2) 특징적인 IR peak와 IR peak의 개수

IR을 이용해서 정성적인 결과, 즉 분자구조 등을 추론하기 위해서는 특정 화학결합은 특정 에너지 범위 내에서 peak 값을 보인다는 것을 이해해야 한다. 이 peak에서 범주를 나눌 때 수소와의 결합, 삼중결합, 이중결합, 그리고 단일 결합 영역으로 분리하여 생각할 수 있다.

① 수소와의 결합

수소와의 결합은은 IR spectrum에서 비교적 높은 에너지를 갖는다. 그래서 파수가 높게 측정되며 크기는 O-H, N-H, C-H 순으로 크다. 한편, O-H는 수소결합을 보이는 대표적인 원자단으로 분석하고자 하는 시료 사이에서 강력한 수소결합을 보이며, 이는 peak의 모양에 큰 영향을 준다. 일반적인 spectrum에서 보여지는 peak와 달리 O-H에 의한 peak는 넓은 형태로 관찰된다. 즉, 높은 파수의 영역에서 범위가 넓은 peak의 유무는 O-H 원자단의 유무를 결정지을 수 있다.

② 다중결합의 IR Spectrum

삼중결합에 대해서는 두가지 종류 C≡O , C≡N 에 대해서만 고려한다. C≡N  결합의 세기가 더 크기 때문에 흡수 시 더 많은 에너지가 필요하며, 더 높은 파수에서 관찰된다. 다만, IR spectrum에서 다중결합 중 이중결합이 삼중결합보다 더 중요하다. 이중결합은 보통 C=O 와 C=C 에 대해 살펴본다. C=O 결합의 peak는 1700 wavenumber보다 더 큰 영역에서 관찰된다. 그리고 C=C 의 경우 1650 wavenumber 근처에서 발견된다. 하지만, C=C 의 peak는 시료의 구조에 따라서 1700보다 약간 적은 위치에서 발견되기도 한다. 앞서 살펴봤듯이 진동에너지는 분자의 질량 또는 결합의 세기에 의해 결정된다. 다만, 원자의 질량에 차이는 거의 없으므로 결합의 세기에 의해 차이가 발생한다고 생각할 수 있다. conjugation이 있는 분자 구조에서는 공명구조가 관찰된다. 탄소사이의 단일결합과 이중결합 사이의 공명이 발생하면 해당 결합은 1.x 결합으로 해석된다. 즉, C=C 에 의해 예상되던 이중결합보다 더 작은 결합세기를 가지므로 1700보다 더 낮은 영역에서 peak가 관찰될 수 있음을 알 수 있다.

③ IR peak의 개수

Theory 4-9에서 살펴본 것처럼 기준 진동 방식에 따라 예측되는 peak의 개수와는 다르게 측정되는 경우가 많다. 기준 진동 방식을 이용해서 예상한 peak 보다 그 개수가 많은 경우와 적은 경우에 대해 아래에 정리했다.

ⅰ) 예측한 수보다 더 적은 수의 peak

- 분자가 대칭적인 움직임을 보일 때

- 분자가 보이는 총 진동 에너지의 종류 중 몇가지의 진동에너지가 비슷한 에너지를 보일 때

- 흡수의 세기가 매우 낮아 관측이 안될 때

- 진동 에너지의 크기가 실험에 사용하는 기기의 관측 가능한 범위 박의 값을 가질 때

ⅱ) 예측한 수보다 더 많은 수의 peak

- 선택전이 뿐만 아닌 진동 양자수의 변화의 크기가 2이상일 때

- 특정 에너지가 2가지 진동 방식의 에너지에 변화를 일으킬 때

Ⅶ. Reference

1. 서강대학교 화공생명공학기초실험1 매뉴얼 2020

2. FTIR Seminar, Jasco

3. 분광학의 기초: 이론, Agilent Technologies, 2016

Ⅰ. Title

접촉각 (Contact Angle

Ⅱ. Purpose

접촉각은 물질의 표면에너지를 측정하고, 물질의 특성을 파악하는데 중요한 역할을 한다. 실험을 통해 주어진 물질의 접촉각을 측정하고, 부착일을 구해본다. 그리고 접촉각이 실험 조건에 따라 어떻게 변하고, 각종 기판에 따라 어떻게 변하는지 관찰한다.

Ⅲ. Theory

1. 표면에너지/표면장력

1) 액상에서의 상호작용

액상 물질은 분자 사이의 상호작용(dipole-diople or Dispersion)을 할 수 있으며, 액체 분자의 위치에 따라서 보이는 상호작용이 다르다.

① 액상 내부의 분자 (Molecule in Bulk)

액상 내의 분자는 인접한, 동일한 분자와 모든 방향에 대해서 상호작용을 하고 있다.

② 액상 표면의 분자 (Molecule in Surface)

해당 분자의 하단부는 동일한 분자와 상호작용을 하고 있다. 반면 해당 분자의 상단부는 다른 분자(액체, 기체)와 상호작용을 하고 있다.

2) 힘의 관점에서 살펴본 표면장력

표면에 있는 분자들에 대해서 액상의 분자 사이에서 작용하는 상호작용과, 합력을 고려하여 아래의 그림으로 표현했다.

표면에서의 힘의 압력들을 모두 더하여 알짜힘을 고려했을 때 물분자들은 서로를 끌어당길 수 있다. 이를 살펴봤을 때 원형인 것을 알 수 있으며, 특정 넓이에 대해 가장 작은 둘레를 갖는다. 이를 실제 3차원 액상에 대해 생각해보면, 일정 부피를 갖는 액상은 표면 분자들의 힘의 상호작용에 의해서 구를 형성할 것이고, 이는 같은 부피에 대해 가장 작은 표면적을 갖는다. 따라서 표면장력(surface tension)은 물질의 표면적을 최소상태로 유지하게 하는 힘을 뜻하며, 그림 2에서 나타난 알짜힘 등을 의미한다.

3) 표면에너지와 표면 장력

그림 2의 오른쪽 그림에서는 분자의 상대적 위치에 따라 상호작용의 정도가 다른 것을 알 수 있다. 물질의 표면에 존재하는 분자들은 상대적으로 결합에 관여하는 정도가 적다. 이는 표면의 분자들은 다른 물질과 결합할 수 있는 여지가 남아있음을 의미한다. 이처럼 물질의 표면이 다른 물질과 더 결합할 수 있는 정도를 표면에너지(surface energy)라고 하며, 표면 에너지가 높은 것은 더 많은 물질과 결합(반응)을 할 수 있다는 것을 뜻하기에 상대적으로 불안정함을 의미한다.

물질은 최대한 안정한 상태를 유지하려 한다. 이를 위해 최대한 표면에너지가 낮은 형태를 유지하려 한다. 앞서 구형의 물체가 가장 낮은 표면적을 갖는다고 했다. 더 낮은 표면적은 물질의 접촉 정도를 낮춘다. 따라서 표면 장력은 물질의 표면 에너지에 의한 불안정도를 최소화하기위해 관여한다.

물질의 표면을 이야기할 때 고체, 액체 그리고 기체에 대해 생각할 수 있으나, 보통 액체와 기체의 경계면에서의 표면에너지를 표면장력으로 말한다.

2. 접촉각

1) 접촉각의 정의

물질의 접촉은 2개 이상의 물질이 관여하기에 각 물질의 표면에너지 변화 정도를 고려하여, 해당 system의 표면 에너지의 합이 가장 작은 형태를 유지하려 한다.

한 system에 G, L, S가 모두 존재하므로 서로 다른 두 phase사이의 계면에너지(장력)는 3가지가 있으며 각각 𝛾LG, 𝛾SL, 𝛾SG이다. 물질들은 표면적이 작을 때 안정해질 수 있으므로 각각의 계면에너지는 표면을 최소화하려는 방향으로 작용하며, 이를 화살표로 나타낼 수 있다. 이 system에는 3개의 상이 동시에 만나는 선이 있는데, 이를 contact line이라고 말하며, 이 지점에서 고체표면 접선과 액체표면 접선이 이루는 각, 즉 𝛾LG와 𝛾SL이 이루는 각도를 접촉각(contact line, θ)라고 한다.

2) 부착일과 접촉일

어떤 액체 또는 고체는 항상 기체와 접촉하고 있다. 그렇기에 𝛾LG와 𝛾SG를 각각 liquid/solid surface free energy라고 한다. 계면이 형성된 것은 새로운 계면(SL)의 형성으로 system의 에너지나 낮아졌다는 것을 뜻하는데, 이 과정을 반대로 수행할 수 있다. 접촉된 액상을 떼어내어(i.e. 새롭게 형성된 SL 계면을 제거함으로써) 원래의 순수한 고체/액체 표면으로 돌아가기 위해 에너지를 가할 수 있는데, 이 에너지의 크기를 부착일(Adhesion of Work, WSL)이라고 하고 식은 아래와 같다.

WSL = 𝛾SV + 𝛾LV - 𝛾SL

3) 퍼짐 계수와 접촉각의 분류

액상이 고체에 도포될 때 고체/액체의 특성에 따라 접촉각이 형성이 안 될 수 있다. 액상 물질이 고체와 접촉각을 형성하는 지를 퍼짐 계수(Spreading Coefficient, S)를 이용해서 예측할 수 있으며 이 계수는 아래의 식을 따른다.

S = Edry - Ewet = 𝛾SV - (𝛾SL + 𝛾LV)

퍼짐 계수는 특정 물질을 고체에 도포할 때 해당 물체가 도포되는 정도를 예측할 수 있게 해준다.

① S > 0인 경우는 Total Wet이라 하며 도포 물질이 기판에 완전히 흡착된다. 이는 𝛾SV가 비교적 큰 상황을 의미하며 상대적으로 기판이 불안한 것을 뜻하기 때문에 더 많은 결합을 할 수 있다. 안정한 상황을 유지하기 위해서 최대한 많은 면적이 도포물질에 의해 덮여야 하기 때문에 total wet을 유지하려 한다.

② S < 0인 경우는 Partial Wet이라 하며 도포 물질이 기판에 일부분만 흡착된다. 이는 𝛾SV가 비교적 작은 상황을 뜻하기에 도포물질에 의해 일부분만 기판이 가려지더라도 안정해지기 때문에 partial wet을 유지할 수 있다. S가 음수일 때만 접촉각을 측정할 수 있다. 접촉각의 크기에 따라서 접촉 상황을 다르게 구분한다.

ⅰ) θ < 90°인 경우는 기판과 도포물질이 접촉상태를 비교적 잘 유지하고 있기에 이를 친수성 접촉(hydrophilic contact)이라고 한다.

ⅱ) θ > 90°인 경우는 기판과 도포물질이 접촉이 잘 이루어지지 않는 것을 의미하고 있기에 이를 소수성 접촉 (hydrophobic contact)라고 한다.

위의 분류는 표면이 친수성인 기판에 대해 논의한 것이며 소수성인 기판은 반대의 경향성을 갖는다. 즉, 기판과 도포물질 둘 중 한 물질의 극성만 알고 있다면 접촉각의 크기를 통해서 나머지 물질의 극성을 추론할 수 있다.

3. Mechanical balance and Young’s Equation

1) Young’s equation과 이 식의 의미

그림 3에서 도포된 물질이 움직이고 있지 않기 때문에 해당 system의 합력의 크기는 0이다. 해당 그림에서 수평방향의 힘의 평형식을 작성해보자.

0=γLVcosθ+γSL-γSG→γSG=γLVcosθ+γSL

우리는 이 식을 Young’s equation이라고 한다. 위의 식은 에너지와 접촉각 사이의 관계를 표현할 수 있다는 데 의미가 있다.

2) 식의 응용

이 식을 이용하면 위에서 언급한 부착일과 펴짐 계수를 액상의 표면장력만 이용해서 표현할 수 있다.

4. GGFY equation
기판의 표면에너지를 설명하기 위해서 GGFY 식이 제안되었다. 이 식은 계면에너지 중 dispersion 에 의한 효과를 중요하게 여겨서 모델링 되었다.

5. HMDS(Hexamethyldisilazane) 기법

기판들은 친수성/소수성 등 다양하게 있는데, HMDS 처리를 진행하면 친수성 기판을 소수성 기판으로 전환할 수 있다. 구체적으로는 표면의 Si-OH를 반응시켜 Si(CH3)3으로 전환하여 표면을 소수성으로 만드는 것이다. 이 공정 처리는 Spin Coating을 통해서 진행될 수 있다. 이 방법은 기판의 가운데에 coating하고자 하는 물질을 도포한 후 고속으로 회전시켜 기판 전체에 코팅물을 도포하는 것이다.

6. 복잡한 표면에서의 접촉각 표현

앞에서 논의한 접촉각은 모두 단일상이고 균열이 없는 기판의 표면에 대해 구한 것이다. 다만 실제 기판은 이보다 복잡한 경우가 많으며 대표적으로 Wenzel State(물리적인 복잡함)와 Cassie-Baxter State(화학적인 복잡함)으로 구분이 가능하다. 이는 기판의 roughness가 가해졌을 때 표면에 air가 trap되면서 접촉각이 변하는 상황에 대해 표현한 것이다.

1) Wenzel State

이 상태는 단일상 표면이 거친 상태를 의미하고, 이때의 접촉각은 아래와 같이 표현한다.

Hydrophilic Surface에 대해서 θreal<90 이고 θideal<θreal 이기 때문에 roughness는 hydrophilic한 정도를 더 강하게 한다. 그리고 hydrophobic surface에 대해서 θreal>90 이고 θideal>θreal 이기 때문에 roughness는 hydrophobic한 정도를 더 강하게 만든다. Wenzel State에서는 접촉각의 오차 정도를 나타내는 hysteresis가 꽤 크게 관찰된다.

2) Cassie-Baxter law

이 상태는 표면에 2개 이상의 물질로 구성이 되었을 때를 뜻하며, 접촉각은 아래와 같다.

Ⅳ. Chemical & Apparatus

1. Chemicals

- Silicon Wafer(3000A), Purified Water, HMDS(Hexamethyldisilazane)

2. Apparatus

- SmartDrop (Femtobiomed Inc), Spin Coater, Hot plate, Syringe(1mL, HSW), Contact Angle Niddle, Sand paper(80 , 400, 800)

Ⅵ. Data & Result

1. 접촉각 및 기타 정보 정리

2. GGFY equation을 이용한 계면 에너지의 계산

1) γLV (표면장력)의 계산

고체의 표면에너지를 계산하기 위해서 주어진 표를 이용해 서 γLV 를 구해보자.

이번 실험은 순수한 물(mass % =0)을 이용했으며 T = 22.6℃ 또는 22.8℃에서 실험이 진행되었다. 그렇기에 선형보간법(interpolation)을 이용해서 각 온도에 대한 표면장력을 추론한 후 고체의 표면에너지를 계산해야 한다.

2) 고체의 표면에너지 γSV 의 계산

1)에서 구한 표면에너지(표면장력)과 GGFY equation, 그리고 Ⅵ-1의 표의 정보를 이용하면 각 실험에서 사용한 고체의 표면에너지를 구할 수 있다.

3. 부착일(WSL), 흡착일(WLL), Spreading Coefficient(S)

전 단계에서 구한 각각의 표면에너지(표면장력) 수치를 이용해서 위에 열거한 부착일, 흡착일 그리고 Spreading Coefficient의 크기를 구할 수 있다.

4. 물질의 조도 (Roughness, R)

순수 Silicon Wafer와 사포를 가한 Silicon Wafer의 표면의 물리적 상태는 분명히 차이가 있기에 조보지를 구해보고, 어떤 사포에 대해서 더 거친 면이 형성되어 있는지에 대해 생각해보자. Surface의 물리적인 변화 정도(i.e.거친 정도) R Wenzel’s Law를 이용해서 구할 수 있다.

Ⅶ. Discussion

1. 실제 공정에 대한 고려: Cassie-Bexer equation의 사용 이유와 유도

이번 실험에서는 roughness의 변화를 가했더라도 기판의 조성이 Si-OH로 모두 동일한 상황이다. (엄밀하게 이야기하면 Roughness 조정 시 wafer에 처리해둔 coating이 벗겨지면 순수한 silicon과 Si-OH의 차이를 생각할 수는 있으나, 해당 효과에 대한 정량적인 해석은 무시하겠다.) 실제 공정에서는 물질의 조성이 complex하다. 이때에는 Cassie-Bexter equation을 사용하는데, 해당 식이 어떻게 유도가 되는 지에 대해서 살펴보자.

위의 상황을 Young Equation을 유도할 때처럼 수평방향을 기준으로 energy balance를 세워보자.

이때 해당 system은 static하기 때문에 변위에 대한 에너지 변화량이 존재하지 않으며 이를 위해서 식을 변형할 수 있다.

우리가 원하는 것은 이 system에서의 접촉각이므로 에 대해 식을 정리하자. 이때 contact angle 사이의 관계식을 얻기 위해서 Young’s equation 를 이용하자.

위의 정리는 2가지 구성물에 대해서만 이야기한 것이며, 일반화하야 n개의 구성물로 이루어진 기판에 대한 contact angle은 아래와 같이 정리된다.

2. 실험 결과 분석과 실험 수행의 질적 평가

1) 실험 전반적인 정보

이번 접촉각 측정 실험에서는 순수한 silicon wafer과 HMDS 처리 기판에 대한 비교, 그리고 순수한 silicon wafer와 각기 다른 사포로 roughness에 변화를 주었다. 이를 위해서 수평을 이루는 기판 위에 액상 droplet을 떨어트려 표면장력을 구하는 sessile drop method 방법을 이용했다. 실험결과 퍼짐 계수 S(mN/m)가 -62.67 ~ -29.22의 범위에서 나타났으며 모두 음수인 것을 확인할 수 있었다. 즉 S < 0이며 partial wet이 진행되었음을 확인할 수 있다. 실제로도 모든 경우에서 접촉각이 측정되었기에 S에 대한 예측은 옳다. 다음으로는 pure Silicon Wafer에 대해서 기판의 극성의 변화와 roughness의 변화가 어떠한 영향을 미쳤는지 살펴보자.

3. Surface State의 결정

Roughness에 대한 분석을 하기 이전에 우리가 만든 Rough Surface가 Homogeneous(Wenzel State)인지 Heterogeneous(Porous, Cassie State)인지를 결정할 수 있어야 한다. 이번 실험에서 Roughness의 조정은 사포에 의해서만 결정이 되었으므로 Surface에 air이 유입될 수 있다. 이 상황을 Cassie-Baxter equation을 이용해서 표현하면 아래와 같다. (SS: Smooth Surface, f1: Solid on surface fraction, f2: air on surface fraction)

water-air contact angle을 180도로 생각하여 식을 정리하면

이때 f1+f2=1이므로 f1에 대해서만 식을 정리할 수 있음

우리가 측정한 surface가 Cassie-Baxter Surface라면 f1≤1 이므로 아래의 관계가 성립한다.

위의 식이 성립한다면 해당 Surface는 Cassie-Baxter State이며 그렇지 않다면 해당 Surface는 Wenzel State임을 말하며, 해당 비율을 표면의 거칠기(Roughness, R)이라고 한다.

80방, 400방, 800방 사포질에 의해 형성된 접촉각에 대해 비율을 살펴보자.

위의 표를 통해서 80방 사포에 의한 표면은 Cassie-Baxter Sate, 400방/800방 사포에 의한 표면은 Wenzel State에 놓여있다. 즉, 80방 사포에 의한 표면은 Water-Liquid 사이에 air가 trap된 공간이 존재하는 것을 뜻하며 400방/800사포에 의한 표면은 그렇지 않다.

4. Roughness와 Contact Angle 사이의 관계

1) Wenzel State Surface와 Roughness 사이의 관계

Smooth Surface - 400방 사포 - 800방 사포에서 거칠기와 접촉각 사이의 관계를 생각해보자. 일반적으로 높은 방수의 사포는 덜 거칠기 때문에 접촉각이 더 작게 감소하며 이에 대한 조도비가 작게 측정이 되어야 한다. 하지만 400방 사포의 R = 1.576이고 800방 사포의 R은 2.916이기 때문에 그 경향성이 반대로 측정이 되었다. 측정의 오류를 원인으로 들 수 있으나, 올바르게 측정이 되었다고 생각하면 Hysteresis에 의해서 이 현상이 발생했다고 생각할 수 있다.

Hysteresis는 예상되는 접촉각보다 더 작거나(Receding Angle) 더 크게(Advancing Angle) 측정이 되는 현상을 말한다. Wenzel State Surface는 특히 hysteresis가 잘 발생할 수 있는 상태이다. 이번 실험이 진행된 Relative Humidity (RH) 16% 정도에서는 hysteresis가 약 15도 정도가 발생할 수 있다. 즉 측정된 값을 기준으로 약 7.5도 정도의 차이가 발생할 수 있음을 뜻한다. 이를 그래프를 통해서 살펴보자.

그 결과 400방과 800방 사포가 가해진 접촉각의 차이가 많이 줄어들 수 있음을 확인할 수 있다.  Roughness는 Surface의 위치에 영향을 받는다. 실제로 400방 사포와 800방 사포의 CA(L)과 CA(R)의 차이가 꽤 나는 것을 통해서 한 번 더 확인할 수 있다. 그리고 CA(R)에 대해 Hysteresis를 이용해서 측정을 진행하면 400방 800방 표면의 CA가 역전이 되는 것을 알 수 있으며, 이는 실험 전에 예상했던 결과와 부합한다.

그렇기에 접촉각을 측정할 때에는 같은 조도라고 예상하는 고체의 표면에 대해 한 곳이 아닌 다른 부위에 대한 측정도 진행이 되어야 하며, 반복적인 측정으로 우연에 의한 접촉각이 아닌 실제 그 표면에 가질 수 있는 접촉각을 측정하는 것이 중요하다.

2) Cassie-Baxter State Surface와 Roughness 사이의 관계

80방 사포에 의해 형성된 rough surface의 거칠기를 Wenzel State라고 생각해서 조도비를 구하면 R=0.86으로 1보다 작게 측정이 된다. 하지만 분석 결과 해당 표면은 Cassie-Baxter State Surface로 Surface와 접촉각 측정을 위해 떨어트린 액체 사이에 air가 trap된 형태인 것을 확인할 수 있다. 그렇기에 Roughness에 대한 영향을 다른 관점에서 살펴볼 필요가 있다. 이 상태의 표면에서는 Hysteresis 발생 정도가 작기 때문이다. (약 2.8도 정도) SS의 CA는 78.2이며 80방 사포에 의해 형성된 표면의 CA는 79.2으로 접촉각의 크기가 증가한 것을 알 수 있다. 물-공기 사이의 접촉각이 180도이기에 접촉 상황에서 공기의 관여가 증가한 것은 CA의 크기가 증가한 것으로 이해할 수 있다. 이를 Cassie-Baxter 식으로 살펴보자.

Surface에서의 Trap된 air의 비율이 증가한다는 것, 즉 f1이 어느정도 감소한다는 것은 해당 surface의 density가 감소하다는 것을 뜻하며, 이는 물질의 거칠기가 증가할 수 있음을 알려준다.

Cassie-Baxter State에 놓이게 되는 표면이 일정 거칠기(Ra)가 증가하게 되면 density가 감소하는 것을 확인할 수 있다. (그래프 C) Hydrophilic Surface에 대해서는 density의 감소는 Contact Angle의 증가로 이어진다. (그래프 A) 즉, 이번 실험에서 SS의 접촉각보다 80방 사포에 의해 거칠어진 표면에서 측정된 접촉각의 크기가 더 크게 측정이 된 것을 설명할 수 있게 된다.

3) 측정의 오류를 반영한 해석

80방 사포에 의해 형성된 Surface가 실제로 Wenzel State였더라도 Receding Angle이 71도 정도로 400방, 800방 사포에 의해 거칠어진 표면의 접촉각에 의해 많이 크다는 것을 확인할 수 있다. 따라서 측정이 잘못되었다면 State의 차이가 아닌, 접촉각의 절대적인 크기가 많이 크게 측정되었음을 예상할 수 있다.

5. 접촉각에 영향을 미치는 추가적인 요인

이번 실험에서는 HMDS처리에 의한 hydrophobic 정도의 증가와 roughness 변화에 의한 표면의 화학적 조성의 변화에 따른 접촉각의 변화를 관찰했다. 접촉각은 이러한 원인과 더불어 다른 요인들에 의해서 그 변화 정도가 다를 수 있다. ① Relative Humidity의 변화는 접촉각에 변화를 가져온다, 이는 단조적인 경향성을 보이기도 하지만 때에 따라서는 그 경향성을 단순히 설명하기 어려울 수 있다.[1][3] ② 온도의 변화는 접촉각의 변화를 가져온다. 온도의 증가는 액체의 표면장력이 감소하므로 Young’s Equation에 적용해보면 cosθ가 증가한다. 이는 접촉각이 작이지는 것을 뜻한다.[3] ③ 접촉각을 측정하기 위해 사용한 액상의 부피도 접촉각에 영향을 준다. 실제 떨어트리는 droplet의 직경D와 기판에 형성되는 원의 직경 d는 분명히 차이가 있다. 부착일은 둘 사이의 비율로도 표현되고 식은 다음과 같다. WSL=πDd/DγLVsinθ  즉, d/D 가 증가할수록 CA가 증가한다[4][5]. droplet의 부피가 증가하면 중력, 압력 등의 영향을 받기 때문에 d/D 가 변하고 이는 접촉각에 영향을 미친다. ④ 새로운 계면을 형성하는데 상호작용을 어느 정도로 고려하는 지에 따라서 접촉각 데이터에 따른 표면에너지가 차이가 날 수 있다. 이번 레포트를 작성할 때 사용한 식은 GGFY equation이다. 이 식은 계면에너지를 dispersion 정도와 polar 상호작용 중 dispersion의 영향력에 집중해서 작성되었다.[4] 하지만 우리가 실험에서 사용한 물처럼 수소작용이 가능하거나 전해질을 droplet으로 사용해서 전기적 상호작용도 동시에 고려된다면 다른 식을 사용해야 한다. 예를 들어 droplet의 분자량과 밀도 사이의 관계도 반영된 GGFY-E 식도 있다.[6] ⑥ droplet의 pH도 접촉각에 영향을 줄 수 있다. 물리적 현상은 강한핵력, 약한핵력, 전자기력, 중력에 의해 설명되는데 접촉각의 경우 기판과 droplet 사이의 전기적 상호작용에 의해 영향을 받는다. pH의 변화는 droplet의 전기적 성질에 변화를 주기 때문에 접촉각이 변화가 있다.[7] ⑦ 추가적으로 계면활성제는 표면장력에 영향을 주어 접촉각과 표면에너지에 영향을 준다. 이 현상을 응용하여 최근에는 안경에 김이 서리지 않도록 도와주는 안경닦이도 만들어졌다.

Ⅷ. Reference

[1] Hołysz, L., et al. "Influence of relative humidity on the wettability of silicon wafer surfaces." Annales UMCS, Chemistry 63 (2008): 223-239.

[2] Wang, J., Wu, Y., Cao, Y. et al. Influence of surface roughness on contact angle hysteresis and spreading work. Colloid Polym Sci 298, 1107–1112 (2020).

[3] Perez-Diaz, J. L., et al. "On the Influence of Relative Humidity on the Contact Angle of a Water Droplet on a Silicon Wafer." ASME International Mechanical Engineering Congress and Exposition. Vol. 56314. American Society of Mechanical Engineers, 2013.

[4] Robert A. Stratton, “The Floatation of Sticky Contaminants from Recycled Fiber Streams”, Institute of Paper Science and Technology Atlanta, Georgia, 17-22 (1991)

[5] KRUSS, “Effect of Drop Volume on Static Contact Angles”, 2004

[6] Aydar, Alev Y., Veronica Rodriguez-Martinez, and Brian E. Farkas. "Determination and modeling of contact angle of Canola oil and olive oil on a PTFE surface at elevated temperatures using air or steam as surrounding media." LWT-Food Science and Technology 65 (2016): 304-310.

[7] Virga, Ettore, et al. "Wettability of amphoteric surfaces: the effect of pH and ionic strength on surface ionization and wetting." Langmuir 34.50 (2018): 15174-15180.

[8] 접촉각이 형성되는 원리와 uncompensated Young's force - 성돌의 전자노트 (tistory.com)

Ⅰ. Title

유기합성 (Grignard Reaction)

Ⅱ. Purpose

1. Grignard 시약을 제조하고, 이를 Ketone과 반응시켜 Alcohol을 합성한다.

2. 생성된 물질을 적외선 분광법 (Infrared Spectroscopy)을 통해 잘 이루어졌는지 확인한다.

Ⅲ. Theory

1. 친핵체와 친전자체의 분류

1) 유기반응과 전자의 이동

유기 반응은 여러 반응물의 결합 사이의 전자 이동을 바탕으로 진행된다. sigma bond는 원자핵사이에 있기에 편재성이 강해 이동하지 못하기에, 유기 반응에서는 특히 pi bond에 있는 전자의 이동에 의해 진행된다. 전자는 홀로 공여될 수 없기에, 반응물들 사이에서 어떠한 물질이 전자를 주고, 어떠한 물질이 전자를 받는지를 아는 것이 중요하다.

2) 친핵체와 친전자체

① 친핵체(nucleophile, Nu)

화학결합을 형성할 때 전자쌍을 주는 물질들을 친핵체로 분류한다. 대표적으로 pi 결합을 형성하는 물질 또는 비공유전자쌍을 갖고 있는 물질들을 말한다. 이러한 특성 때문에 친핵체는 루이스 염기에 해당한다.

② 친전자체(electrophile)

친핵체와 반대로 화학결합 형성 시 전자쌍을 받는 물질을 친전자체라고 한다. 붕소처럼 축소된 옥텟을 갖고 있거나 상대적으로 양전하를 띠고 있는 물질들을 예로 든다. 전자를 받는 물질이기에 친전자체는 루이스 산을 말한다.

친핵체와 친전자체는 절대적이지 않으며, 각 반응 조건에서 반응물의 acidity 등을 고려하여 판단해야 한다.

2. 친핵성 첨가반응과 친전자성 첨가반응

유기 반응은 크게 첨가, 치환, 제거반응이 있다. 그 중에서 친핵체와 친전자체를 중요하게 언급하는 반응은 첨가반응(Addition Reaction)이기에, 이를 간단히 살펴보자. 첨가반응은 Markovnikov 규칙을 따르도록 진행되거나, 때에 따라서는 이에 반하는 반응 메커니즘을 갖는다. 그 중에서도 이번 실험에서 직접적으로 사용되는 친핵성 첨가반응에 대해 설명하겠다. 탄소 C에 전기음성도가 큰 O와 N이 연결되면 상대적으로 탄소가 (+) 전하를 띨 수 있다. 유기 반응 시 이 탄소는 친핵체로부터 공격을 받아 sigma bond를 형성할 수 있다. 이 반응을 친핵성 첨가반응이라고 한다. 친핵성 첨가반응은 C=O, C=N과 같은 결합을 갖고 있는 물질에서 잘 관찰되며 그 예로는 알데하이드와 케톤이 있다.

3. Grignard reagent의 제법과 Grignard Reaction

1) Girgnard reagent

다중결합이 포함되어 있는 탄소에 대해서 새로운 탄소를 결합하는 것은 크게 어렵지 않다. 반면 탄소 사이에 sigma 결합만 존재한다면, 새로운 탄소를 결합하는 데에는 어려움이 존재한다. 이는 유기급속 화합물을 이용해서 해결할 수 있다. 유기 금속 화합물은 Organolithium(R-Li), Grignard Reagent(R-MgBr), 그리고 Gilman Reagent(R-Cu + R-Li)가 있다. 그 중에서도 Grignard Reagent는 좋은 친핵성을 보이기에 많이 사용된다. Grignard Reagent는 알킬 할라이드를 이용해서 합성할 수 있다. (여기서 말하는 할라이드는 F를 제외한 17족 원소 Cl, Br, I를 말한다.) Grignard Reagent는 강한 염기성을 보이며(강한 친핵체) 그렇기에 산-염기 반응이 쉽게 진행된다.

2) Grignard Reaction

① reaction에서 사용하는 용매

Grignard Reagent가 system에 포함된, 즉 Grignard Reagent를 합성하거나, Grignard Reagent를 이용해서 친핵성 반응을 진행하거나 모두 용매를 물로 사용하면 안된다. 산-염기 반응에 의해서 원하지 않던 물질이 생성되기 때문이다. 대표적으로 사용하는 용매는 ether이며, diethyl ether와 THF 등이 있다. 뿐만 아니라 ether는 Grignard Reagent를 안정하게 만들 수 있기에 사용된다. ether 가운데에 있는 산소의 비공유전자쌍이 마그네슘과 결합해서 배위화합물을 형성할 수 있기 때문이다.

② Grignard Reaction

Grignard reaction은 염기성 상황에서 진행되는 대표적인 친핵성 첨가반응 중 하나다. 친핵체는 Grignard Reagent에 연결되어 있는 알킬기인 탄소음이(Carbanion)이며, 상대적으로 (+) 전하를 띠는 카르보닐기에 연결된 탄소 C를 공격한다. 반응 도중 알콕시화 마그네슘 중간체가 형성된다.

Ether 용매 조건 하에서 알데하이드랑 반응하면 2차 알코올을 형성할 수 있으며 ketone과 반응을 하면 3차 알코올을 형성할 수 있다.

4. IR Spectroscopy

1) 분자의 에너지와 IR Spectroscopy의 개념

분자의 에너지는 양자화되어 있으며, 전자에너지 준위, 진동에너지 준위, 회전에너지 준위의 합으로 구성된다. 전자에너지 준위가 가장 크며, 회전에너지 준위가 가장 낮다. IR Spectroscopy(이하 IR)는 적외선을 광원으로 삼아 미지 시료의 정보를 추론하는 분광 분석법이다. 적외선 영역의 빛의 에너지는 크기 않기에 분자 결합의 진동에너지에만 영향을 줄 수 있다. 즉 IR을 통해서 분자 결합의 에너지 측정을 목표로 하고, 분자 결합의 종류는 peak가 나타나는 에너지의 범위를 통해 추론한다.

2) 측정원리 및 해석방법

IR에서 적외선의 경로는 광원 -> 간섭계 -> 시료 -> 검출기를 따른다. 이때 첫 측정은 Background로만 진행으로 하며, 두 번째에는 미지 시료와 Background(KBr 등)의 혼합물을 시료로 삼아 분석을 한다. 두 실험 결과에 나타난 파장에 대해 Sample / Background의 비율을 IR의 실험 결과로 얻으며, 여기서 나타나는 peak가 속한 에너지 범위와 reference를 비교하여 시료가 갖고 있는 결합을 추론한다. 이를 통해 IR은 분석의 범위가 한정적이기 때문에 정보를 어느 정도 알고 있는 시료에 대해 분석하는 것이 유리한 것을 알 수 있다. 예를 들어 정제 과정 후 목표한 물질을 잘 분리했는지, 순물질에 대해 어느 정도 물질이 벗어났는지를 확인하는 데 유리하다. 이번 실험을 통해 얻은 물질은 Triphenyl Methanol이며, 해당 물질의 분자구조와 IR 스펙트럼은 아래와 같다.

Ⅳ. Chemicals & Apparatus

1. Chemicals

2. Apparatus

syringe(주사기), septa, vial(공병), reflux condenser, N2 balloon, dropping funnel(분액 깔때기), beaker, torch, FT-IR, 3-neck round bottom flask(3-neck RB), stirring bar, rotary evaporator, aspirator

Ⅴ. Procedure

1. Grignard reagent (Phenylmagnesium Bromide) 제조

1) 3-neck RB에 마그네슘 200mg과 stirring bar를 넣은 뒤, septa로 밀봉하여 reflux condenser에 clip을 사용하여 연결한다.

2) torch로 flame drying을 진행하고 잠시 상온에서 식힌다.

3) syringe로 anhydrous diethyl ether 3mL를 넣고 10분 이상 stirring한다. (에테르를 뽐을 시 질소 purging법을 따라 진행한다.)

4) 이어서 syringe를 이용하여 dried bromobenzene 0.9mL와 anhydrous diethyl ether 3mL를 순서대로 천천히 3-neck RB에 넣어준다.

5) 미지근한 물을 비커에 담아 RB에 열을 전달한다.

6) 발열반응이 진행되며 자연적으로 ehter가 reflux가 된다. (약 1시간 정도 소요)

2. Triphenyl methanol 제조

1) 1에서 만든 Grignard reagent를 식힌다.

2) Benzophenone 1.5g을 ether 3mL에 녹여서 3-neck RB에 넣어준다.

3) 찬 물로 RB를 식히고 saturated ammonium chloride solution (실험실에 비치된 것은 가루(염)형태이므로 Solubility를 확인하여 수돗물로 제조 후 사용

4) Ether(non-hydrous, solvent용)를 더 넣은 후 solid(creamy-white)가 사라질 때까지 흔들어준다.

5) Dropping funnel에 생산물을 옮겨 담고 물 층을 제거한 뒤, NaCl 용액으로 씻어준다.

6) 다시 물 층을 분리한 후 anhydrous magnesium sulfate(고체)를 넣어 drying한다.

7) 거름종이를 활용하여 drying agent를 제거하고 Rotary evaporator를 이용해 Ehter를 날린다.

8) Hexane 10mL를 넣고 재결정시킨다. (잘 되지 않으면 2-propanol을 소량 넣어준다.)

9) 재결정을 통해 얻은 수득물을 하루정도 말려준다.

3. FT-IR 분석

1) 시료와 KBr을 1:1 비율로 섞은 후, 막자사볼로 간다. (실험 결과가 잘 안 나오면 KBr의 비율을 늘린다.)

2) Disc kit에 시료를 고르게 담는다. 이때 벌어지는 공간은 종이 등으로 채워준다.

3) 가압프레스로 압축하여 투명한 디스크를 만든다.

4) FT-IR 기기를 작동시키고, 컴퓨터에서 OMNIC 프로그램을 켠다.

5) 투과모드로 Background를 먼저 찍고, 시료 홀더에 디스크를 고정시켜 IR 스펙트럼을 얻어낸다.

Ⅵ. Data & Result

1. 시약의 색 변화

유기 합성 과정에서 반응 단계에 따라서 색 변화가 나타났으며, 구체적으로는 아래와 같았다.

2. IR spectrum 관찰 결과

1) IR에서 관찰된 시료의 peak와 해당 peak에 대응하는 원자사이의 결합은 아래와 같다.

2) Reference Data와 비교해봤을 때 다른 wavenumber에 대해서는 거의 동일한 경향성을 보이지만, 1397.77과 1384.66지점은 reference에는 나타나지 않은 peak임을 알 수 있다. 그렇기에 우리가 얻은 시료는 순수한 triphenylmethanol이 아니라 다른 물질이 혼합되어 있음을 알 수 있다.

Ⅶ. Discussion

이번 실험은 Grignard Reagent를 이용해서 Triphenylmethanol을 합성하고, 이를 IR을 이용해서 잘 합성되었는지 확인하는 것을 목표로 한다. 알려져 있는 유기물을 합성하려면 반응 메커니즘 등을 고려해서 실험환경을 잘 조성하는 것이 중요하다.

1. Triphenylmethanol synthesis의 정성적 해석

위의 메커니즘을 살펴보면서 이번 실험이 어떻게 진행되었는지, 주의할 점은 무엇이었으며 이를 최대한 어떻게 해결하려 했는지를 살펴보자. 이번 실험은 크게 2가지 반응단계를 거친다. 첫 단계인 Grignard reagent synthesis 과정에 대해서 살펴보자.

위에서 제시한 반응이 잘 진행된다면 좋겠지만, 발생할 수 있는 문제점들이 존재한다. 이는 대개 만들어진 Grignard reagent가 매우 강한 base이기 때문에 높은 반응성을 보이는 것으로부터 기인한다. 첫 번째로는 산-염기 반응의 진행에 따라서 girgnard reagent가 추가적인 반응을 보일 수 있다. girnard reagent보다 상대적으로 acidic한, 대표적으로 물, phenol derivatives, -SH, -NH 등과 반응을 할 수 있다. 이번 실험의 경우에는 기기 중의 수분, 공기 중의 수분 등이 synthesis 과정에 개입을 할 수 있으며, 이 반응은 벤젠과 MgBr(OH)를 생성한다. 이를 요약해서 아래에 나타냈다.

MgBr(OH)는 ether에 대해 낮은 용해도를 보인다. 그렇기에 반응이 진행되는 Mg의 표면 근처에서 앙금의 형태로 남을 수 있다. 이는 Mg와 Bromobenzene의 접촉 빈도를 낮추어 기대하던 것보다 Grignard reagent가 덜 생성될 수 있다. 이를 예방하기 위해서 이번 실험에서 flame drying을 진행해서 기기 안에 남아있는 수분을 최대한 제거하고 anhydrous diethyl ether와 dried bromobenzene을 사용해서 반응에 수분이 개입되지 않도록 했다. 두 번째로는 girnard reagent가 생성되면, 미처 반응하지 못한 반응물 bromobenzene과 반응을 추가적으로 진행하여 byproduct인 biphenyl을 형성할 수 있으며 이 반응을 요약해서 아래에 표현하였다.

이는 준비했던 reactant가 원하는 생성물이 아닌 부산물이 생성되도록 함으로써 기대했던 양보다 grignard reagent가 더 적게 생성되도록 한다. 이 추가 반응은 system의 온도가 충분히 높거나 bromobenzene의 유입 속도가 너무 빠름 등 반응 속도가 빨라질 때 생길 수 있는 문제점이다. 이를 예방하기 위해서 bromobenzene을 dropwise하게 system에 유입하도록 해야 하고, 이를 위해서 N2 balloon을 사용했다. 문제점들을 잘 고려해서 반응을 진행했다면 반응이 진행되고 있는 혼합물 용액의 색이 변하는 것을 관찰할 수 있다. 직접 실행을 진행하지 않아 정확한 색을 구분할 수는 없었으나, 무색에서 어두운 녹색 계열로 이동한 것을 알 수 있다. 유기물의 색 변화는 mixture의 conjugation bond의 정도가 달라짐에 따라 변하며, 용액의 색이 변한 것을 통해서 물질 사이의 전환이 잘 발생했음을 확인할 수 있었다. 또한 실험을 직접 진행하지 않아 뚜렷한 관찰은 할 수 없었지만, 해당 반응이 잘 진행되었다면 system이 boiling하는 것을 확인할 수 있다. 이는 Grignard reagent synthesis가 발열반응이기에 열을 방출하기 때문이며, 이 열이 용매로 전달되었기에 발생하는 현상이다. 실제로 boiling으로 지나치게 ether가 기화되는 것을 방지하기 위해서 reflux condenser를 설치했다.

두 번째 단계로, 우리가 실제 목적으로 했던 Triphenylmethanol synthesis에 대해 생각해보자. 이 반응은 girgnard reagent를 이용한 친핵성 첨가반응 과정을 거쳐 진행된다. 친핵성 첨가반응 메커니즘을 거쳐 진행되는 반응을 요약하여 아래에 표현했다.

ketone인 benzophenone에서 상대적으로 음전하를 띠는 carbon에 Grignard reagent에서 electron이 상대적으로 rich한 phenyl이 공격을 하면서 triphenylmethanolate가 형성된다. 이는 우리가 얻으려고 했던 생성물의 음이온 형태로, 목표했던 생성물을 얻으려면 여기에 추가적으로 protonation 과정이 필요하다. 이를 위해서 포화 NH4Cl 수용액을 사용한다. 이 수용액은 NH4+가 상대적으로 산성을 보이는 특성을 이용한다. NH4+ -> NH3 + H+ 반응이 발생할 수 있으며, 여기서 나온 H+으로 triphenylmethanolate를 protonation을 하면 triphenylmethanol을 얻을 수 있으며, 이를 요약하면 아래와 같다.

이 과정은 acid-base reaction이기 때문에 반응이 비교적 잘 진행된다. 한편, 포화용액을 사용하는 것은 이온 - 물 사이의 상호작용을 최대로 하여 물이 girgnard reagent 등 system에 미치는 영향을 최소화하기 위함이다. 위의 반응을 거치면서 마찬가지로 용액의 색이 변하는 것을 관찰할 수 있다. 최종적으로 진행된 반응의 %수율은 100%가 아니다. 이상적으로 반응이 진행되었을 때 첫 번째 단계에서 2개의 elementary reaction을 가지며 각각의 수율은 70%이며, 두 번째 단계에서 nucleophilic reaction과 acid-base reaction의 수율도 마찬가지로 70%다. 즉, 전체 반응의 수율은 약 24%정도이다. 정량적 수치에 대한 해석은 추후에 하도록 하며, 지금은 수율이 100%가 아닌 사실에 대한 의미를 살펴보자. 수율이 100%가 아니라는 것은 해당 system에 우리가 원했던 main product인 triphenylmethanol과 반응에 참여하지 못한 반응물들이 혼합된 형태일 것이다. 최대한 정제된 물질을 얻기 위해서 main product의 손실을 감수하고 재결정을 진행했다. 현재 혼합물에서 용매로 작용하는 물질은 물과 ether이다. triphenylmethanol은 alcohol이지만 phenyl의 steric effect로 인하여 ether에서 더 잘 용해된다. (다만, 물에 의한 용해효과가 미미하지만 발생하긴 한다.) 그렇기에 물의 밀도가 더 큰 사실을 이용해서 물을 먼저 분리해낸다. 그 다음으로는 불순물을 제거하기 위해서 반응성이 낮은 이온을 포함한 NaCl 수용액을 이용해서 다시 세척을 진행하고 물을 제거한다. 마지막으로 물과 alcohol의 -OH의 상호작용 등으로 ether 속에 포함되어 있는 물을 제거하기 위해서 drying agent로 사용되는 anhydrous MgSO4를 이용하고 filtering을 통해 제거한다. (필요에 의하면 drying agent의 전, 후 질량을 측정해서 ether에 포함되어 있던 수분의 양을 측정할 수도 있다.) 마지막으로 바로 evaporator를 이용해서 crude triphenylmethanol을 얻을 수 있으며 경우에 따라 hexane을 이용해서 보다 정제된 triphenylmethanol을 얻을 수 있다. 마지막으로 얻어낸 triphenylmethanol이 실제로 맞는지를 확인하기 위해서 IR spectrum을 측정했다. reference table에 비해서 실제 spectrum이 아래로 shift된 것을 보아 상대적으로 분자사이의 결합이 강하게 나타났음을 생각해볼 수 있다. 1397.77과 1384.66지점은 reference에는 나타나지 않은 peak가 발견되었으며, reference table을 따르면 해당 지점은 phenol류로 판단이 된다. 이번 반응 메커니즘에서 phenol이 합성될 수 있는 반응은 보이지는 않으나, 우연에 의해 진행이 되었을 수도 있으며 측정이 잘못되었을 수도 있다. 이처럼 IR 분석이 갖고 있는 한계가 있기 때문에 최근에는 NMR 기법 등을 이용해서 보다 정밀한 분석을 진행할 수 있다.

3. Triphenylmethanol synthesis의 정량적 해석과 impurity

산업측면에서 stochiometric relationship은 매우 중요하다. 그 이유는 크게 2가지이다. 첫 번째로, 준비한 반응물에 대해 얻고자 하는 생성물이 어느 정도 생성되었는 지를 추측할 수 있다. 두 번째로는 필요한 생성물의 양이 있을 때 반응물이 어느정도 필요한지를 역으로 계산해낼 수 있다. 이번 실험을 예로 들면 최종 생성물인 Triphenylmethanol을 합성하기 위해서 필요한 마그네슘, bromobenzene, benzophenone, diethyl ether의 양을 추측할 수 있다. 이번 실험은 유기 합성을 ‘진행’하는 것을 목표로 하기 때문에 준비된 반응물에 대해서 이론적으로 어느 정도의 triphenylmethanol이 생성될 것인지를 살펴보자. grignard reagent synthesis와 triphenylmethanol synthesis에서 관찰되는 반응계수는 모두 1:1로 동일하기에 이를 이용해서 계산을 진행하였다.

1) Grignard reagent synthesis

reaction Ph + MgBr -> Ph-MgBr은 실제로 2단계의 반응 메커니즘을 가지며, 구체적인 정량적 해석을 위해서 살펴보자. 각 단계에서 반응한 정도는 rate of extend ξ로 표기했다.

2) Triphenylmethanol Synthesis

즉 정상적으로 합성이 진행되었다면 이번 실험을 통해 얻은 Triphenylmethanol의 질량은 0.513g이여야 한다. 실험 과정에 포함되어 있지는 않았지만 얻은 물질의 purity를 아는 것도 중요하다. IR spectrum의 경우 impurity를 측정하기에는 어려움이 있기에 대표적인 impurity 측정 방법에 대해 소개하려 한다. 가장 보편적인 방법은 시료의 질량과 이론상 생성된 질량의 비율을 구하는 것이다. 반응의 불충분 진행, 물질의 손실, 불순물 포함 등으로 인해서 질량이 다르게 측정되는 경우가 많으며, 둘의 오차율을 구하는 방법이다. 또 다른 방법으로는 TLC 크로마토그래피를 이용한 측정 방법이 있다. 크로마토그래피를 이용한 정제 방법은 이동상의 종류에 대한 물질의 이동 정도가 잘 알려져 있다. 그렇기에 이를 reference로 삼아 실제 얻은 product의 이동 정도와 비교하여 오차율을 구하면 impurity를 알 수 있다.

4. Triphenylmethanol synthesis의 개선

특정 유기 화합물의 합성 메커니즘이 발견되었다면, 이를 개선하는 것도 중요하다. ‘개선’의 범위는 매우 넓으며, 반응 속도가 빨라지는 것 등이 포함된다. 이번에 synthesis를 어떻게 하면 더 잘 진행되도록 할 수 있는지 생각해보자. 우선 Mg를 활성화하는 것을 한 예로 들 수 있다. Grignard reagent 합성 과정에서 Mg가 반응을 위해 활성화되기 위해서 오랜 시간이 필요하다. Mg를 grinding하거나 스크래치를 낸다면 접촉면이 늘어나서 반응이 더 잘 진행될 수 있다. 또한 Grignard reagent 합성 진행 전에 iodine chip을 같이 넣어 반응을 진행하면 반응이 더 잘 진행된다. 또한 반응물을 바꿈으로써 반응 정도 변화에 영향을 줄 수 있다. 이번 실험에서 사용하는 benzophenone에 포함되어 있는 phenyl기는 1,3축 상호작용으로 측정하는 A-value의 값이 3.0 정도로 꽤 큰 편이며 첨가하는 탄화수소도 Phenyl이기 때문에 합성 시 불리할 수 있다. 그렇기에 초기 반응물을 benzophenone이 아닌 methyl benzoate를 사용하는 방법이 있다. metyl의 A-value는 0.7 정도로 phenyl에 비하면 매우 작기에 gridnard reagent가 더 잘 접근할 수 있으며, 이 물질을 이용한 반응 메커니즘을 요약하면 아래와 같다.

Ⅷ. Reference

1. Tangjie Zhang, The grignard synthesis of triphenylmethanol, Organic Chemistry, 2015, 288-292

2. Timothy S. Eckert, An Improved preparation of a Grignard reagent, Journal of Chemical Education 1987 64 (2), 179, DOI: 10.1021/ed064p179

Ⅰ. Title

증기압 측정

Ⅱ. Purpose

1. 증기압과 동적 평형 상태에 대해서 이해한다.

2. 상평형 그림에 대해서 이해하고, 그 중에서도 증기압곡선에 대한 지식을 습득하여 압력과 끓는 점 사이의 관계를 이해한다.

3. 온도에 따른 증기압 변화를 나타내는 식인 Clausius-Clapeyron 식을 유도해본다.

4. 실험을 통해 그래프를 plot하여 물이 증발할 때의 엔탈피 변화를 구해본다.

Ⅲ. Theory

1. 동적평형 (dynamic equilibrium)

가열 등 특정 물질에 변화를 가할 때 거시적으로 물질에서의 변화가 관찰되지 않는 순간이 존재한다. 즉, 특별한 driving force가 존재하지 않는 이 상황을 놓고 변화를 가한 system이 ‘동적 평형’ 상태에 놓여있다고 말한다. 한편, 동적 평형 상태 system은 미시적으로는 항상 움직이고 있다. 예를 들어 phase transition이 진행되는 system이 동적 평형에 놓였을 때, boundary를 통해서 미시적으로는 항상 분자들의 transition이 발생하고 있다. 다만, 전환/역전환의 비율이 같아 변화가 없어 보인다.

2. 증기압 (vapor pressure)

증기압은 액체 및 고체가 증발할 수 있는 압력을 뜻한다. 이는 증기가 고체 또는 액체와 동적평형을 이루고 있을 때의 포화증기압의 크기를 뜻한다. 이 상황을 이용하기 위해서는 증발(evaporation)와 응축(condensation)에 대한 이해가 필요하다. 액체 및 고체의 분자사이의 인력은 기체에 비해 매우 크다. 그렇기에 상대적으로 인력이 약한 표면으로부터 증발이 발생한다. 다만, 증발된 기체상의 물질은 표면에 충분한 에너지를 갖고 충돌하면 다시 응축되어 액체 또는 고체 상태로 돌아간다. 증발하는 물질의 양이 많을수록 응축이 되는 정도도 증가하기에 특정 시점이 되면 증발 정도와 응축 정도가 일치한다. 이때 해당 system은 동적 평형을 형성하며, 이때 표면 근처에서 측정한 기체의 압력을 증기압이라고 한다. 증기압의 측정을 위해서는 증발한 물질이 system 주변에 잔류해야 한다. 이를 위해서 측정은 보통 closed system에서 진행한다.

3. 상 변화 (phase transition)

1) 상 변화의 정의

특정 상황에 놓여있는 물질의 화학적 조성 및 물리적 상태를 상(phase)라고 한다. 보통 분자 사이의 거리를 기준으로 그 거리가 가까운 순으로 고체, 액체, 기체라고 분류하지만, 특정 지점에서의 특성이 이 셋과는 구별되는 경우에는 새로운 phase로 정의하여 물질의 특성을 설명한다.

2) phase stability의 기준과 상 변화 진행 이유

물질들이 갖고 있는 에너지를 gibbs energy G로 표현할 수 있다. 이는 extensive property이기 때문에 비교를 위해서 intensive property인 molar gibbs energy Gm을 chemical potential μ로 정의한다. chemical potential의 크기가 낮을수록 해당 물질이 더 안정한 상태에 놓여있다고 한다.

물질들의 변화 가능성은 ‘해당 물질이 특정 phase에서 가장 안정한 상태에 놓여있는가’를 기준으로 파악한다. gibbs energy는 state function이기에 exact derivative를 따라 infinitesimal gibbs energy를 표현할 수 있다.

dG = Vdp - SdT

maxwell relationship을 이용하면 다음과 같은 표현을 얻을 수 있다.

∂μ∂Tp=-Sm  & ∂μ∂pT=Vm

이때 phase transition이 대개 등압조건에서 진행하는 것을 목표로 하기에 왼쪽의 식을 이용하면 phase transition이 진행되는 이유를 알 수 있다.

Sm은 모든 온도 범위에서 항상 양수이기에 μ 는 항상 음수이며, Sm(g)>Sm(l)>Sm(s) 의 크기관계를 갖는다. 이를 고려하여 μ-T  그래프를 얻을 수 있으며 그림 1로 표현했다.

특정 온도구간에서 물질들은 하나의 phase를 가지려 하며, 가장 낮은 μ 를 유지하려 한다. 이를 위해 system의 온도가 높아질수록 분자 사이의 거리를 늘려 안정한 상태를 유지하려 한다. 그렇기에 특정 온도를 기준으로 phase transition이 발생하며, 이 현상이 관찰되는 온도를 상 변화 온도(transition temperature)이라고 한다.

3) 상변화의 분류 (The Ehrenfest classification of phase transitions)

한편, chemical potential이 변화하는 경향을 기준으로 phase transition을 분류할 수 있는데, 이를 Ehrenfest classification이라고 하며, 그림 2처럼 표현한다.

이는 transition temperature에서 μ 의 변화 경향성을 기준으로 분류한다. 만약 해당 지점에서 μ 가 미분가능하게 연결되어 있다면 Second Order transition이라고 한다. 이 변화에서는 maxwell relationship을 이용했을 때 Vm과 Hm이 연속인 것을 알 수 있다. 반면, μ 가 미분 불가능하게 연속이라면 First Order transition이라고 한다. 이때에는 transition point에서 Vm과 Hm이 증가하는 것을 확인할 수 있다.

4. 상평형 곡선 (phase equilibrium diagram)

Theory 3에서 살펴본 순수한 물질에 대한 phase transition을 p-T의 관계를 통해서 살펴볼 수 있으며 이를 그래프로 표현한 것을 상평형 곡선(phase equilibrium diagram)이라 했다.

특히 phase boundary는 상변환이 진행되는 지점으로 두 다른 phase가 동적평형을 이루고 있다. 그림 3의 오른쪽 상평형 곡선을 기준으로 AT를 승화곡선, BT를 융해곡선, CT를 증기압력곡선이라고 하며 각각 고체, 액체, 기체의 증기압력을 표현한 것이다. 물의 융해곡선은 다른 물질과 달리 음의 기울기를 갖는데 이는 물의 밀도 변화 경향성이 다른 물질과 그 특성을 달리하기 때문이다. 추가적으로 T는 고체, 액체, 기체가 동시에 존재하는 삼중점이며, C는 임계점으로 증기압력곡선의 최대값이 형성되는 점을 말한다. 그림 3의 phase diagram은 순물질에 대한 것으로 정확한 수치를 얻으려면 system을 한 물질로 빈틈없이 채운 후 p와 T를 조정하면서 나오는 특성들을 측정해야 한다.

5. Clausius-Clapeyron equation

액체의 아래 첨자를 1, 증기의 아래 첨자를 2라고 하자.

상 변화 과정에서 동적 평형을 이루고 있으므로 (가정)

dμ1=dμ2⋯①

이때 G = H - TS, H = U + pV 이므로 이 수치들을 infinitesimal scale에 대해 표현하고 chemical potential을 표현하기 위해 단위 몰 당 수치를 얻으면
dμ=Vmdp-SmdT⋯②

①, ②를 이용해서 식을 정리하면

Vm,1dp-Sm,1dT=Vm,2dp-Sm,2dT⇒dpdT=∆Sm∆Vm⋯③

VLE에서는 온도 변화가 없으므로 G = H - TS를 통해서 ∆S=∆H/T 임을 얻을 수 있으며 상 변화 중  ∆Vm=Vmg-Vml 이지만, 기체의 몰 부피가 액체에 비해 매우 크기에 무시하면 (가정)

dpdT=∆HmTVmg⋯④

infinitesimal property에 대해 macroscopic property로 전환하기 위해서 적분을 진행해야 한다. 이때 생성되는 기체를 이상적이라 하고 (가정), 상 변화 중 필요한 열의 양이 온도에 대해 독립적이라고 하면 (가정)

Vmg=RTp⇒lnpP0=-∆HmR1T+C⋯⑤

이 식을 Clausius-Clapeyron equation이라고 하며, lnp와 1/T에 대해 plot해서 얻은 그래프의 기울기를 이용하면 해당 phase transition에서의 필요한 열의 양(엔탈피)를 얻을 수 있다. P0 은 log의 진수 부분에는 무차원수를 사용해야 하기 때문에 붙여준 수치이며 실험에서 사용한 단위를 따른다. C는 plot된 그래프에 의해서 정해지는 상수다. 이를 무시하고 싶으면 두 상태에 대해 Clausius-Clapeyron equation를 적용한 아래의 식을 이용하면 된다.

lnpapb=-∆HmR1pa-1pb

6. 기체의 상태 표현

1) 이상기체 상태 방정식

기체분자운동론을 만족하는 기체를 이상기체(ideal/perfect gas)라고 하며, 몇 가지 property에 대한 아래의 관계식이 성립한다.

pV=nRT

(p: 기체의 압력, V: 부피, n: 기체의 몰수, R: 기체 상수, T: 기체의 온도)

2) 실제 기체 방정식

하지만 실제 기체는 이상기체와 달리 고유의 부피를 갖고 있으며, 분자 사이의 상호작용이 존재한다. 이처럼 이상기체 방정식에서 실제 기체가 보이는 거동성을 반영하여 이상기체 상태방정식을 기반으로 modeling한 여러 식이 있는데, 대표적인 몇 가지에 대해 살펴보겠다.

① Viral Coefficients와 Compressibility factor

이상기체 상태 방정식을 power series형태로 expansion하여 실제 기체의 거동성을 수학적으로 해석할 수 있도록 만든 식이다.

pVm=RT1+BVm+CVm2+⋯

여기서 표현되는 B와 C를 Viral Coefficient라고 한다. 다만, C는 B의 비해 매우 작은 경우가 많기에 편의를 위해서 계산 시 C에 대해 무시하고 계산하는 경우가 많다. Virial Coefficient는 온도에 의한 함수 B(T), C(T) 등으로 표현된다.

식의 길이가 길어지는 것을 방지하기 위해 이상 기체의 몰 부피에 대한 실제 기체의 몰 부피의 비율을 compressibility factor Z로 정의하고, 이를 이상기체 방정식에 적용한다.

pVm=ZRT

(Vm: 실제 기체의 몰부피, Z: compressibility factor)

한편, 위의 두 식을 p, V, T에 대해 정리하여 표현하면 Viral Coefficient와 Compressibility factor 사이의 관계성을 확인할 수 있다. C를 무시하면,

Z=pVmRT=1+BVm+CVm2+⋯⇒ Z=1+BpRT

② Vander Woals Equation과 reduced property

이상기체와 실제 기체 사이의 거동성의 차이 중 기체 자체의 부피 및 기체 사이의 상호작용을 주요 차이점으로 두고 이상기체 식을 개선한 것을 Vander Woals Equation이라고 한다.

p=RTVm-b-aVm2

원래는 a와 b는 기체의 종류마다 다른데, critical point에 대한 현재 상태의 비율을 통해 얻은 reduced property를 이용하면 이 방정식을 기체의 종류와 관계없이 적용할 수 있게 된다.

Ⅳ. Apparatus & Chemicals

Chemicals

표  SEQ 표 \* ARABIC 1 실험에서 사용하는 물질의 정보

Ⅴ. Procedure

1. Round-bottom flask에 증류수 100mL를 넣는다.

2. 냉각기와 Reflux condenser를 연결한다,

3. 냉각기의 스위치를 켜고 냉각수의 온도가 15℃ 이하가 될 때까지 기다린다.

4. Vacuum pump를 작동시켜 manometer의 눈금이 200mbar가 될 때까지 감압한다.

5. Heating mantle의 전원을 켜고 온도를 천천히 증가시킨다.

6. 물이 끓을 때까지 기다린다.

7. 물이 끓었을 때의 manometer와 온도계의 압력과 온도를 측정하여 기록한다.

8. Stopcock를 열고 공기를 주입하여 manometer의 눈금을 상승시킨다.

9. 200mbar부터 1013mbar까지 5 point 이상 압력조건에서 물이 끓을 때의 온도를 측정한다.

10. 실험을 2회 반복한다. 실험을 종료한 후 장갑을 끼고 round-bottom flask를 정리한다.

Ⅵ. Data & Result

1. 실험 1

2. 실험 2

3. 실험 결과 정리 및 오차율

Ⅶ. Discussion

이 실험은 특정 압력에서 물의 끓는점을 측정하여 증기압력과 끓는점 사이의 관계를 이해하는 것을 목표로 한다. 사용하는 물질의 특정 지점에서의 state를 결정하기 위해 phase rule에 대해 고민해볼 필요가 있다. air에 대해 무시했을 때 liquid to vapor transition이 발생하는 지점에서 # component = 1, # phase = 2 이므로 #DOF = #component - # phase + 2 = 1 -2 + 2 = 1이다. 즉, T와 p 중 한 가지 값만 결정하면 나머지 값도 결정되는 것을 알 수 있다. 실험 상에서 온도는 열을 다루어 조정하는데, 열은 관성을 갖고 있기에 원하는 수치로의 자유로운 조정이 힘들기에, 압력을 결정짓고 끓는 점의 온도를 측정하는 방법으로 실험을 설계했다. 실험에서 압력은 manometer를 이용해서 측정한다. 이는 gauge pressure을 표현해줌으로써 system의 순수한 압력을 표현되도록 한다.

물의 기화는 대표적인 1st order phase transition이기에 phase가 변할 때 molar volume과 molar enthalpy가 급격하게 변한다. 특히 엔탈피 변화는 몇 가지 가정을 이용해서 얻은 선형 방정식 Clausius-Clapeyron equation을 이용해서 구할 수 있다. 실제 진행한 실험 환경과 theory 5에서 설정한 가정들을 비교하여 오차 발생 원인 및 실제 값은 어떻게 나올지를 비교해보자. (discussion의 더 나은 전개를 위해 4가지 가정에 대해 임의로 번호를 매겼다.)

(가정 1) 분석하고자 하는 증기가 이상기체이다.

증발을 통해 형성되는 기체 분자를 온전한 이상기체로 고려하기에 실험 환경은 온도가 낮으며 어느정도 압력이 가해지고 있다. 그렇기에 Compressibility factor를 이용해서 실제로 slope은 어떠한 수치를 갖게 될 것인지 확인해보자. 특정 지점에서 Z=pVm/RT=1+Bp/RT  이므로,

dpdT=∆Hvap, mTVmg=∆Hvap, mZRT2  ⇒ lnpP0=-∆Hvap, mZmeanR1T+C

slope=m=-∆Hvap, mZmeanR⇒∆Hvap, m=-ZmeanRm=Zmean∆Hvap,m

second virial coefficient table for water에 나와있는 수치에 대해 linear interpolation을 적용하여 실험에서 사용한 온도에서의 B의 값을 얻었다. 이 값들에 의해 결정된 Z를 적분을 이용한 평균값 정리를 통해서 실험한 압력 구간에 대한 Zmean 을 결정했고, 이를 이용해서 얻은 보정된 수치 ∆Hvap, m 를 표 5에 정리했다.

표 5 실제 기체임을 고려하여 계산한 mean compressibility factor 및 ∆Hvap, m

실제 기체라고 생각했을 때 구한 엔탈피 변화는 실험 1과 2에서 모두 이상기체일 때보다 감소한 것을 확인할 수 있다. 이 결과는 정성적으로도 설명이 가능하다. 실험은 적당한 압력과 온도 하에서 진행되기 때문에 기체 분자들의 attraction이 우세한 상태에 놓여있다고 생각할 수 있다. 그렇기에 이상기체에 비해 실제 기체 분자들의 거리는 비교적 짧다. 즉, 액체 상태의 물이 이상 기체가 되는 데 비해 더 짧은 정도의 거리만 떨어지면 되므로 더 적은 에너지가 있어도 충분히 phase transition이 진행될 수 있다. 다만 이 modeling 방법도 한계가 존재한다. Z도 T에 대한 함수로 표현될 수 있음에도 이 값을 상수로 고려하여 equation을 얻었다는 점이다. Vander Woal’s equation에서 표현된 몰 부피 혹은 virial equation에서 표현된 몰 부피를 바로 대입해서 식을 얻는다면 비교적 정확한 분석이 가능할 것이다. 다만, 정성적인 설명에 따라 엔탈피 값의 변화 경향성은 Z를 이용한 modeling과 같을 것이며 변화 정도에만 차이가 있을 것으로 예상된다.

(가정 2) 기체의 몰 부피가 액체에 비해 매우 크기에 무시한다. ∆Vm=Vmg-Vml≈Vmg

만약에 반응 system의 크기가 충분히 크다면 이 가정에 대해서는 크게 언급할 필요가 없지만 실험 scale이 그 정도는 아니기에, 만약 계산과정에서 Vml 을 고려하면 어떻게 될 지 생각해보자. 어떤 vapor-liquid system이 liquid to vapor transition을 겪고 있다고 하자. 이때 기체의 몰 부피는 system의 온도와 압력에 의해 결정되며 물의 몰 부피는 거의 일정하다. 이를 설명한 것이 아래의 그림 7이다.

위에서 얻은 ∆Vm=RT/p-k 를 활용하여 식을 전개하면,

dpdT=∆HmT∆Vm=∆HmTRT/p-k

위의 first order nonlinear ODE를 풀면,

C1+Ei-k∆Hmp+∆Hmek∆HmpRT=fx,y=0    (Ei(x): exponential integral function)

하지만 위의 식은 implicit function이며 Ei(x)를 exponential하게 표현하는 것에는 어려움이 있다. 그렇기에 RT/p와 k의 unit은 cm3/mol으로 동일할 수 있는 사실을 이용하자. k는 항상 양수이므로 기체의 부피는 액체의 몰 부피를 무시했을 때보다 감소한다. 물의 부피를 무시했을 때보다 기체가 이동할 수 있는 부피의 감소한 정도를 비율 상수 a로 정의하고 이를 이용해서 표현하면,

dpdT=∆Hvap, mTRT/p-k≈∆Hvap, mTaRT/p=∆Hvap, mpaRT2⇒lnp=-∆Hvap, maR1T+C

slope=m=-∆Hvap, maR⇒∆Hvap, m=-aRm=a∆Hvap,m

(a(T): T에 대한 함수로 표현되는 비율 상수, 0<a(T)≤1))

이 유도를 통해서 정확히 어느 정도 값이 변화하는 것은 알기 힘드나, 물의 부피가 고려되는 상황에서의 증발 엔탈피가 그렇지 않은 경우보다 더 작다는 것을 알 수 있다. 다만 H2O(g) 몰 부피는 매우 H2O(l) 보다 매우 크기에 a의 값이 1에 수렴할 것이고 구체적으로 값을 구하더라도 큰 변화는 없을 것으로 예상된다.

(가정 3) 증발 시 필요한 엔탈피의 양은 온도에 대해 독립적이다.

엔탈피를 온도에 대해 독립적이라고 이야기했지만, 엔탈피 H를 maxwell relationship을 이용하면 exact differential dH = TdS + Vdp인 것을 알 수 있다. 즉, 실제 엔탈피는 측정하는 환경(온도, 압력 등)에 의해 영향을 받으며 phase transition을 분류한 그림 2에서도 이를 확인할 수 있다. 다만 모든 온도 구간에 대해 구하는 것은 많은 시간과 비용이 요구되므로 몇몇 지점에 대해서만 측정을 진행했으며 least squares approximation (이하 LSA)을 이용해서 얻은 그래프를 분석이 사용했다. LSA는 특정 지점들의 정보에만 의존하기에 한 부분의의 측정이 잘못되면 얻고자 하는 것과 차이가 날 수 있다. 실제 실험 1의 정확도 R은 99%로 확인되는 반면 실험 2는 89%로 비교적 신뢰도가 낮은 편에 속한다. 증발 시 필요한 엔탈피의 실제 크기는 Properties of Saturated Steam Table을 통해서 확인할 수 있다. Table에 없는 수치는 linear interpolation을 이용했으며 오차율은 (실험 - 문헌정보)/실험*100(%)를 각 실험에 대해 적용했다.

표 6 Steam table에서의 엔탈피 값과 실험에서 얻어진 엔탈피 값에 대한 증/감 표현 오차율

실험 1과 2 모두 실제 포화 상태의 온도가 아닌 구간에 대한 값들을 계산한 것이기에 정량적인 분석은 불가능 하다. 실제 측정되어야 하는 값보다는 더 적은 에너지가 필요하다고 측정되었다는 정보만 절댓값을 취하지 않은 오차율을 통해서 생각해볼 수 있다. 보다 주목해야 하는 점은 포화상태가 형성되는 지점에서의 온도가 증가할수록 상변화 시 필요한 엔탈피의 값이 작아진다는 것을 정성적으로 이해하는 것이다. 온도가 올라갈수록 액체의 물 분자는 더 높은 에너지를 갖고 있는 상태를 유지한다. 그렇기에 기체상태가 되기 위해서는 보다 적은 에너지만 가해주면 되는 것이다.

위의 가정 1 ~ 가정 3을 살펴봄으로써 실제 물이 끓기 위해서는 이상적인 상황하고 약간 다를 수 있다는 것을 알 수 있다. 그 중 1013mbar에서 측정한 수치에 대해 이야기를 해보자. 이 압력의 크기는 알려져 있는 대기압의 크기(1atm=1.013bar=760torr)와 부합한다. 이 지점에서의 물의 끓는 점은 100℃이며 두 번의 실험에서 이와 부합한 것으로 나타났다. 하지만 IAEA(International Atomic Energy Agency)에 따른 계량법에 따르면 대기압 하에서의 물의 끓는점을 99.98℃으로 정의한다. 이 차이는 실제 지구상에서 원소들의 동위원소가 존재하기 때문에 발생했다. 불순물이 포함된 바닷물 중 순수한 물에 대해, 동위원소를 포함하고 있는 물분자들의 비율을 고려하여 IAEA는 그 기준을 정했다. 이렇게 정의한 물을 VSMOW(Vienna Standard Mean Ocean Water)이라고 하며, 이를 이용해서 계량을 진행하면 물의 물리적 거동성을 보다 정확하게 설명할 수 있으며 다른 물성 측정의 기준으로 사용된다. 계량에 사용하는 물이 동위원소를 포함하지 않는 H2O여도 끓는점이 정확히 100℃가 아닐 수 있다. 대표적으로는 대기압을 정의한 상황과 실제 상황이 부합하지 않는 경우를 이유로 들 수 있다. 압력의 단위로 사용하는 torr는 0℃ 상에서의 수은 1mm가 갖는 압력을 표현한 것이다. 하지만 대부분의 끓는점은 상온에서 측정되기에 오차가 생길 수 있다. 또한 대기압은 공기의 무게를 기준으로 정의한 단위이다. 그렇기에 대기의 상태에 따라서 영향을 많이 받는다. 예를 들어 태풍이 형성되면 주변 공기의 압력이 낮아지기에 끓는점이 내려갈 수 있다. 그 외에도 공기 중의 기체 들이 실제로 물에 용해될 수 있기에 사용하는 물이 순수한 물이 아닌 점을 들 수 있다. 이를 예방하기 위해서 증류수를 사용해야 하며, 증류수만 포함되어 있는 피스톤을 준비한 후 실험을 진행해야 한다. 하지만 이번 실험에서는 이러한 점이 지켜지지 못했기에 Clausius equation을 유도할 때 했지만, 미처 살펴보지 못한 마지막 가정에 대해서 이야기하겠다.

(가정 4) 상 평형 진행 중에는 liquid H2O와 vapor H2O는 평형을 이루고 있다.

실험 중 온도를 측정하는 순간은 우리가 액체의 끓음을 관찰하는 순간이다. 하지만 열의 전달이 infinitesimal하게 잘 진행이 되었다면 물은 over-boiled될 수 있다. 이는 물의 상변화가 phase transition을 따르며 수학적으로 subcritical Pitchfork Bifurcation으로 해석될 수 있기 때문에 생각될 수 있는 상황이다. 즉 끓는 점이 되었음에도 불구하고 끓음이 발생하지 않을 수 있다. 하지만 이 현상의 확률은 거의 낮으며 그렇기에 기체와 액체 상태의 물이 서로 동적 평형을 이루고 있는 것은 맞다고 할 수 있다. 다만 이 평형을 단순히 순수한 물에 대한 평형상태로는 살펴보기 힘들다. vacuum pump 및 stopcock를 이용해서 실험 system의 압력을 조정하는데 그 크기는 물이 아닌 기체인 공기의 출입으로 조정되기 때문이다. 그렇기에 이번 실험은 물을 condensable component로 갖는 gas-liquid system 하에서 증기압을 측정했다고 생각하고 현상들을 설명해야 한다. 이 system에서 Rault’s Law for single condensable species이다. 이 개념은 gas-mixture에서 condensable species의 partial pressure가 시스템에서의 pure-component vapor pressure와 같다는 것을 의미하며, 식으로 나타내면 아래와 같다. 여기서는 water이 condensable하기에,

Pw=ywP=P*w(T)

즉, 우리가 측정했던 증기압은 공기 + 기체상의 물이었던 것이므로 Rault’s Law를 적용하여 순수한 물에 대한 증기를 얻어낸 뒤, 이에 대해서 다시 Clausius- Clapeyron equation을 적용해서 해석해야 한다. Properties of Saturated Steam Table을 이용해서 관측된 boiling point에 대응되는 압력은 기체상태일 때의 순수한 물의 압력이다. 이를 이용해서 system에서의 공기의 몰분율, 물의 몰분율을 각각 얻을 수 있으며 이 정보를 통해 얻은 순수한 물의 압력을 얻어낼 수 있다. 이를 바탕으로 얻은 Clausius- Clapeyron equation의 기울기로 필요한 엔탈피의 양을 다시 계산해보자.

표 7 Rault’s Law를 적용해서 얻은 pure water vapor (partial pressure)에 대한 정보

system의 model을 변형하여 얻은 정보를 표 7에 정리했다. 이 표에서 몇 개의 사실들을 확인할 수 있다. 우선, pure-water에 대한 정보가 매우 유사한 것을 확인할 수 있으며 증발 엔탈피가 41.5kJ/mol 정도인 것을 얻었다. 이는 앞서 표 6에서 표현한 온도 범위에 대한 엔탈피 값 중 중앙값과 유사한 수치이기에 온도의 분포에 대한 엔탈피 값이 잘 계산되었음을 확인할 수 있다. 그리고 두 equation의 신뢰도가 상승했으며, 특히 실험 2의 경우는 중간에 있던 noise값이 사실은 공기에 의했던 것을 확인할 수 있다. 이를 통해서 우리가 실험한 system이 gas-liquid system인 것을 다시 확인할 수 있으며, 이 상황에서의 분석은 Rault’s law가 적용되어야 하는 것을 알 수 있다.

증기압에 대한 논의는 화학공학 및 열역학에서 많이 논의되는 주제 중 하나이다. 실제로는 순물질보다는 용액이 2개 이상의 액체로 구성이 된 경우를 많이 다루게 되며, 이러한 용액의 거동성은 분별증류 등에 적용된다. 많은 석유 등 많은 액체 혼합물이 있겠지만 그 중에서도 2종류의 volatile liquid로 이루어진 ideal solution은 어떤 거동성을 보이는지 살펴보자. 이 혼합 용액 또한 Rault’s law를 이용하여 해석한다.

A와 B를 volatile한 liquid이며 두 liquid가 solution을 구성하고 있다고 하자. 이때, 두 물질의 조성에 따라서 형성되는 증기압의 크기는 바뀔 것이다. 이때 해당 용액의 전체 증기압은 기체의 몰 분율을 이용해서 표현할 수 있으며 이는 액체의 몰분율과 차이가 있다. 이는 두 용매 사이의 volatility가 다르기 때문이다. 그림 8의 왼쪽의 그림에서 보다 liquid-vapor의 정보를 모두 표현하고 싶을 때 그림 8의 오른쪽의 그림으로 p-z(fraction)선도를 얻는다. 이는 lever rule 등을 이용해서 해당 system이 갖고 있는 intensive property에 따라서 어떻게 액체의 조성이 구성되는지, 증기압의 조성이 구성되는 지를 해석할 수 있게 돕는다.

Ⅷ. References

1. Atkins, P W, and Paula J. De. Atkins' Physical Chemistry. Oxford: Oxford University Press, 2010.

2. Smith, J. M. (Joseph Mauk), Introduction To Chemical Engineering Thermodynamics. New York: McGraw-Hill, 2018

3. Felder, R. M., & Rousseau, R. W, Elementary principles of chemical processes. New York: Wiley, 2018

4. Allan H. Harvey and et. al, Correlation for the Second Virial Coefficient of Water, J Phys. Chem. Ref. Data, Vol 33, No. 1, 2004

5. IAEA, Reference Sheet for International Measurement Standards, VSMOW & SLAP reference sheet, 2006

1. system & surrounding

1) system의 종류

어떤 반응 정보를 해석할 때 우주(universe) 전체를 고려하는 것이 아닌, 관심 있는 부분을 분석한다. 이를 계(system)이라고 하며, 이를 제외한 나머지 부분을 surrounding이라고 한다. system과 surrounding의 boundary를 기준으로 열과 물질의 흐름 여부를 따라 system을 다음과 같이 분류할 수 있다.

2) system에서 진행되는 반응에 의한 열교환

system이 isolated만 아니라면 system과 surrounding 사이에서 열 교환이 발생할 수 있다. system에서 진행되는 반응에 의해 열이 유입되면 이 system에서 진행되는 반응을 흡열 반응 (endothermic reaction)이라고 한다. 반대로 system내의 반응에 의해서 system의 온도가 내려간다면 이 반응을 발열 반응 (exothermic reaction)이라고 한다.

2. 내부에너지와 엔탈피

1) 내부 에너지 (internal energy)

system의 전체 에너지를 의미하며 potential energy와 kinetic energy의 합을 의미한다. 한편, isolated system에서는 system에 가해진 일 w 또는 열 q에 의해서 internal energy의 변화량을 측정할 수 있다.

∆U=w+q

2) 엔탈피 (enthalpy)

internal energy와 달리 system의 volume이 자유롭게 별할 수 있을 때 내부 에너지의 변화는 system의 부피 변화를 유발할 수 있기 때문에 항상, 가해진 열에 비하여 변화하는 정도가 작다. 즉, 압력이 일정한 상황에서 외부에서 가해준 열 에너지를 내부의 enthalpy 변화량과 같다고 정의하고, 이를 식으로 표현하면 다음과 같다.

H=U+pV  ⇒  ∆H=qp

한편, 우리가 생각하고 있는 일반적인 상황은 closed or isolated system이다. 하지만, open system에서 엔탈피를 설명할 수 있다. 유체가 open system을 형성하는 것은 특정 공간을 정상적으로 흐르고 있음을 의미한다. 유체가 갖는 내부 에너지를 U 라고 할 때 이를 제외하고 유체를 흐르게 할 수 있는 일(에너지)이 필요하다. 일반적으로 기체의 일은 expansion work를 따르므로 에너지 pV 에 의해 기체가 흐르며, 이를 유동에너지라고 한다. 내부에너지와 엔탈피의 개념을 이용하면 다음과 같은 식을 유도할 수 있다.

dU=dw+dq=-dpV+dq

dH=dU+d(pV)

dH=dq  ⇒  ∆H=q

이는 flow system에서는 열량의 변화량이 엔탈피의 변화량임을 알려준다.

3. 고분자 물질의 특성

1) 고분자의 특이적 거동

고분자는 일반적인 단분자와는 다른 거동성을 보인다. 단순히 크기만 커서 그런 것은 아니며, 아래의 세 가지 이유 때문이다.

① 사슬의 뒤얽힘 (chain entanglement)

고분자가 단량체 사이의 결합에 의해서 형성된다 단량체를 A라고 했을 때 단순한 -A-A-A-A- 형태로 존재한다고 생각할 수 있다. 하지만. 단량체 사이의 상호작용에 의해 유연한 형태로 존재한다. 즉, 항상 선형성을 보이는 것이 아니라 서로가 꼬인 형태로 존재할 수 있다. 그래서 특정 온도에서는 고 분자를 쉽게 늘일 수 있지만, 또 어떤 온도에서는 고분자에 변형을 주는 것이 어렵다.

② 분자 사이의 상호작용에 의한 가중 (summation of intermolecular force)

분자 사이에서는 다양한 상호작용이 존재한다. 일반적으로 공유결합, 이온결합, 수소결합, 쌍극자-쌍극자 결합, Van der Waals 상호작용이 존재한다. 고분자는 많은 단량체로 구성이 되어 있기 때문에 각각의 상호작용이 서로 중첩될 수 있다. 즉, 고분자 사이의 상호작용이 강해질 수 있어 예상과는 다른 경향성이 관찰될 수 있다.

③ 느린 움직임 (slow motion)

작은 분자는 독립적으로 행동할 수 있기 때문에 빠른 속력을 가질 수 있다. 하지만, 고분자는 작은 분자들이 결합한 형태로 존재하기 때문에 각 단량체의 움직임들에 의한 알짜 움직임을 관찰할 수 있다. 따라서 고분자는 매우 느린 움직임을 보이며, 이는 용액에서 점도를 결정하는데 영향을 미친다.

2) 고분자의 가열과 상전이

고분자 물질도 물질의 한 종류이기 때문에 가열을 하면 상이 변화한다. 하지만, 단순한 분자들과는 달리 위의 언급한 고분자만의 거동성 때문에 일반적으로 분자와는 다른 몇 가지 물리적 상태를 관찰할 수 있다.

① 유리 전이 온도 (glass transition temperature Tg)

유리와 같은 비정질 고체가 가열에 의해 점성이 있는 상태로 변화할 수 있는 지점을 유리 전이 온도라고 한다. 예를 들면 고체 상태로 존재한 고분자가 고무 같은 상태로 변하는 지점을 뜻한다. 즉, 고분자가 움직이기 시작하는 지점을 의미한다. 고분자는 같은 구조가 지속적으로 관찰되기 때문에 측정 사슬을 단위 길이(segment)로 본다. 각 단위 사슬은 온도가 증가하면 회전을 할 수 있는데, 이 상태의 온도는 유리 전이 온도를 갖는다. 유리 전이 온도는 DSC를 이용하면 측정을 할 수 있으며, 이에 대해서는 DSC 부분에서 자세하게 소개하겠다.

② 결정화 온도 (crystalline temperature Tc)

안정 상태에 있는 고분자는 기본적으로 사슬이 얽힌 상태, 즉 무정형 상태(amorphous state)로 존재한다. 하지만, 특정 온도에 도달하면 고분자가 준 결정화 상태(semicrystalline state)에 도달한다. 이 현상이 나타나는 지점의 온도를 결정화 온도라고 한다. 결정화 온도가 될 수 있는 지점은 넓으나 결정 생성이 가장 빠르게 진행되는 지점의 온도를 결정화 온도로 정의한다.

③ 용융온도 (melting temperature Tm)

용융 온도는 고분자가 고체 상태에서 액체 상태로 변화할 수 있는 지점을 의미한다. (비결정성 고분자의 경우는 논의에서 제외한다,) 다만, 그 기준을 명확하게 할 필요가 있다. 결정이 열에 의해서 모두 녹아 용융 상태가 될 때까지 가해진 열은 상변화 온도와 같이 잠열로써 물질에 흡수된다. 결정성 고분자의 경우에는 최후의 결정이 용융화 될 때의 열을 용융점이라고 한다.

4. 열 분석 (Thermal Analysis)

특정 물질이 용해하는 등 상태의 전이가 발생할 때 물리적이 상태가 변하며, 이 과정에는 항상 열이 흡수되거나 방출된다. 열을 표현할 수 있는 지표는 다양하나, 각각의 특성에 맞는 측정 방법이 존재한다. 열 분석 방법에는 어떤 종류가 있는지 아래의 표로 정리했다.

1) DTA와 DSC의 비교

이 중에서 이번 실험에서는 DTA와 DSC에 대한 실험을 진행하므로, 이에 대해서 살펴보도록 하자. 각각의 특징을 간단하게 개괄해보도록 하자. DTA는 온도에 변화에 따라 시료 및 기준물질 사이에 발생하는 온도차를 측정하는 것이며, DSC는 온도의 변화에 따라 시료와 기준 물질 사이에서 흐르는 열의 양을 측정하는 방법이다. 즉, 두 방법 모두 에너지의 변화가 수반됨을 알 수 있다. 두 열분석 방법의 특징을 비교해보도록 하자.

두 분석 방식은 각 특징에 대해 서로 다른 성격을 갖고 있다. 이제 각 측정 방법의 원리를 살펴보도록 하자.

2) DTA(Differential Thermal Analysis)의 원리와 특징

DTA는 일정한 속도로 시료에 온도 변화를 주었을 때 reference와 시료 사이의 온도 차이를 측정하고 이를 열량으로 변환하여 그 값을 측정하는 것이다. DTA 실험은 시료(s)와 reference(r)사이의 온도 차이를 측정하고 온도를 측정하여 온도를 표현하고 두 온도 사이의 차이를 그래프로 표현할 수 있다.

∆T 그래프에서 peak가 시작하는 지점은 반응의 시작 혹은 상전이의 시작을 의미한다. 또한 peak의 정점은 해당 반응이 종결되는 지점을 의미한다. Tg는 유리전이 온도, Tc는 결정화 온도, 쓰은 용융 온도, Td는 산화 온도를 말하며, 온도를 더 가하게 되어 시료가 분해되는 지점도 존재할 수 있다.

3) DSC(Differential scanning Calorimetry)의 원리와 특징

DSC는 온도 변화에 대한 시료의 에너지 변화를 측정하는 열 분석 방법이다. 다만, reference와 시료에 동시에 열변화를 주어 reference와 시료가 갖는 에너지 차이를 함수로 표현한다. DSC는 일반적으로 전력 보상 DSC (power compensation DSC)와 열 흐름 DSC (heat flux DSC)이 있다.

① 전력 보상 DSC (Power Compensation DSC, 이하 PC-DSC)

PC-DSC는 시료와 reference를 가열을 각각 분리하며, 가열로도 독립적으로 분리되어 있다. 다만, 각각의 가열로는 Pt reinforcement(Pt sensor)로 연결이 되어 있다. 시료의 온도가 변하면 reference와 시료의 온도 차이를 감지하여 이를 보완하기 위해 전기에너지를 공급한다. 즉, 일정한 압력이 가해진 상황에서 이동한 에너지를 측정하므로 dH/dt를 온도에 대한 함수로 표현한다. 한편, DSC 곡선에서도 peak가 관찰되는데 peak의 크기는 엔탈피의 변화와 비례한다.

peak의  넓이=k∆H

다만, 전기에너지의 변화를 이용해서 에너지 변화를 측정하는 것이므로, 시료 및 장치의 열용량, 열전도도 등은 k값에 영향을 주지 않는다. 즉, 상수 k 단순한 값의 환산을 위해 사용된 것이며 온도를 독립변수로 갖지 않는다.

PC-DSC 분석법에는 장점과 단점이 존재하는데, 이를 아래의 표로 정리했다.

② 열 흐름 DSC (Heat Flux DSC 이하 HF-DSC)

HF-DSC는 PC-DSC와는 다르게 하나의 열원으로부터 시료와 reference가 같이 가열된다. 그리고 두 물질 사이의 온도 차이가 감지 sensor에 의하여 감지된다. 그리고 시료-reference 온도 차이가 발생하더라도 단순한 온도의 차이만 감지될 뿐 열 변화를 보상하기 위한 에너지 흐름은 발생하지 않는다. 즉, 단순한 온도 차이가 열량의 차이로 해석되어 결과값을 얻기 때문에 DTA의 원리와 비슷하다. HF-DSC에서는 여러 열적 정보(시료 및 장치의 열전도도, 열용량 등)의 영향이 존재하기 때문에 이를 보정을 해야 정확한 데이터를 얻을 수 있다. HF-DSC도 마찬가지로 장단점이 존재하며, 아래의 표에 정리하였다.

③ DSC 측정 시 필요한 조건 및 유의사항

ⅰ) 시료의 형태 - 파우더, 필름, 칩, 슬러리, 겔, 용액 등 다양한 형태로 이용 가능하다.

ⅱ) 시료의 중량 - sample의 양이 적은 것이 여러 변수를 고려했을 때 실험을 진행하기 편하다.

ⅲ) 시료 packing - 시료와 plate 사이의 접촉을 최대로 하는 것이 좋기 때문에 균일하게 채운다.

ⅳ) 승온 속도 - 승온 속도는 분해능. 전이 온도, peak에 영향을 미치기 때문에 적절히 고려하여 설정한다.

ⅴ) 측정 환경 - 열에 대한 안정성을 요구하므로 질소, 헬륨을 주로 사용한다.

4) DSC의 결과 분석

DSC를 통해 얻은 그래프는 heat flow를 표현하나 엔탈피의 정의에 따라서 ∆H=q 라고 생각할 수 있다. 이 사실을 바탕으로 고분자 시료에 대한 여러 물리량들을 분석할 수 있다. 일반적으로는 DSC 분석 결과로 얻은 그래프와 base line 사이의 넓이를 이용하여 값을 구한다.

m×∆Hm=k×A

m : 시료의 질량, ∆Hm : 단위질량당 엔탈피 변화, k : 기기 별 상수, A : base line - peak 면적

그리고 이 특성을 이용하면 고분자가 가열에 의해 보이는 물리량들을 측정할 수 있다.

① 흡열 반응 및 발열 반응

흡열 반응은 base line을 기준으로 peak가 위로, 즉 위로 볼록한 그래프가 관찰될 때 해당 구간에서 흡열 반응이 진행되었다고 한다. 이는 흡열 반응에서 엔탈피 변화량이 양수 값을 갖기 때문이다. 반대로 발열 반응은 base line을 기준으로 peak가 아래로 형성되어 아래로 볼록한 그래프가 관찰되는 구간에서의 반응을 말한다. 발열 반응에서는 엔탈피의 변화량이 음수 값을 갖기 때문이다.

② 유리 전이 온도

유리 전이 온도 이전의 base line과 유리 전이 온도 이후의 base line을 기준으로 해당 구간에서 maximum slope를 갖는 직선을 그어 onset, end point를 구한다. 두 지점의 평균 온도를 유리 전이 온도로 그어 생각할 수 있다.

③ 결정화 온도 및 결정화도(crystallinity)

그림  SEQ 그림 \* ARABIC 7 결정화 온도 및 결정화도 그래프

결정화 온도는 peak가 최대로 나타나는 지점의 온도를 말한다. 한편, 결정화도는 결정성 고분자가 어느 정도로 결정화가 되었는지 확인할 수 있다. 이는 해당 peak를 포함하는 구간에 base line을 긋고 결정화도를 생각할 수 있다.

crystallinity=∆H∆H  at 100%

위의 식에서 ∆H 는 base line - peak의 넓이이며, ∆H  at 100% 은 Polymer Data handbook을 기준으로 한 α-crystalline material의 엔탈피 변화량이다.

④ 용융 온도

그림  SEQ 그림 \* ARABIC 8 용융 온도 그래프

고분자의 특성을 설명에서 말했듯이, 유리 전이 상태와 결정 상태를 거쳐 결정이 모두 사라질 때 까지의 온도를 용융 온도라고 한다. 이 부분도 그래프의 peak가 나타나는 부분을 용융 온도로 정의한다.

⑤ 열용량 Cp

열용량은 시료의 온도를 1℃ 또는 1K를 올리는데 필요한 열량을 의미한다. 단위는 JK-1 이다. DSC 결과 분석에서는 결과로 관찰된 heat flow와 승온 온도를 이용하면 열 용량을 구할 수 있다.

heat flow  Q=Qt

heating rate T= ∆Tt

heat capacity Cp=Q∆T=Q/t∆T/t=QT