Hplc

 

 

 

Ⅰ. Title

High Performance Liquid Chromatography (HPLC)

 

Ⅱ. Purpose

1. HPLC의 이론 및 기기조작을 통하여 혼합 액상의 성분을 분석한다.

2. 크로마토그래피의 원리와 물질의 몰흡광계수를 통해 시료의 정량, 정성 분석 방법을 익힌다.

 

Ⅲ. Theory

1. 크로마토그래피(chromatography)의 정의와 종류

크로마토그래피는 혼합물 중 유사한 성분들을 띠는 물질들을 분리할 수 있는 분리법이다. 이 분리법은 이동상-시료-정지상 사이의 상호작용을 이용해서 물질을 분리해낸다. 그래서 이동상을 기준으로 기체 크로마토그래피와 액체 크로마토그래피로 분류할 수 있다. 또한 정지상의 형태에 따라 column 크로마토그래피, 평면 크로마토그래피, 얇은 막 크로마토그래피로 분류할 수 있다. 뿐만 아니라 이동상-정지상 사이의 특이한 상호작용을 이용하는 친화성 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 그리고 크기 배제 크로마토그래피가 존재한다. 

 

2. 이동상(mobile phase)과 정지상(stationary phase)의 특성

1) 이동상과 정지상의 특성 - 정상 크로마토그래피와 역상 크로마토그래피

일반적으로 크로마토그래피는 이동상과 정지상, 그리고 시료 사이의 상호작용 정도로 혼합 시료를 각각의 성분으로 분리할 수 있다. 이동상 내의 시료와 정지상의 친화도가 강하다면 시료가 더 느리게 이동한다. 반면, 친화도가 낮다면 이동상을 따라서 빨리 이동할 수 있으며 이는 더 빠른 분류를 할 수 있다. 이처럼 물질 사이의 상호작용으로 시료의 이동 정도를 구분할 수 있다. 분자간 상호작용을 구분 짓는 큰 기준은 분자의 극성 여부이다. 이동상과 고정상 사이의 극성을 어떻게 설정하는 가에 따라 크로마토그래프는 2가지 종류로 구분되며, 이를 아래의 표로 정리하였다.

	정상 크로마토그래피	역상 크로마토그래피
고정상의 극성	높음	낮음
이동상의 극성	비교적 낮음	비교적 높음
시료성분 용출순서	무극성이 빨리 용출	극성이 빨리 용출
이동상의 극성과 용출속도의 관계	용출 속도가 느려짐	용출되는 속도가 빨라짐

표  SEQ 표 \* ARABIC 1 정상 크로마토그래피와 역상 크로마토그래피의 비교

2) 이동상의 이동방법

column을 이용하는 크로마토그래피의 경우, 시료를 위에 넣어 아래에서 시료를 분리하는 형태를 취하는 경우가 많다. 이 과정에서는 중력을 drive force로 하여 분리가 진행될 수 있으나, 더 높은 효율 원하면 압력 차이를 이용할 수 있다. 대표적인 예시로는 이번 실험에서 사용하는 HPLC 기법이 압력을 이용하여 크로마토그래피를 이용할 수 있다. 이는 drive force 세기의 차이로만 설명할 수 있으며, 실제로 보이는 이동상의 이동 방법의 원리는 2가지 정도가 있다.

① 등용매용리(Isocratic Elution)

isocratic elution은 시간의 흐름에 따라 이동상의 조성이 일정한 이동상의 흐름을 의미한다. 그러므로 column 내에서 이동하는 시료의 이동속도는 시간이 지나도 고유한 값을 갖는다. 즉, 혼합물 시료 중 각 성분의 극성 등 특성에 따라 다른 이동 속도를 보여줄 수 있으나 그 속도는 시간에 대한 등속도 운동을 보이는 것을 의미한다. 또한 column에 가해지는 압력도 서로 일정하게 설정하는 경우가 많다. 다만 분리하고자 하는 혼합물의 polarity 범위가 넓다면 친수성 물질의 경우 column retention이 좋지 않아 빠르게 용출이 될 수 있으며 소수성 물질의 경우에는 retention이 지나치게 발생하여 용출이 되지 않을 수 있다.

② 농도구배용리(Gradient Elution)

gradient elution은 시간의 흐름에 따라 이동상의 조성이 변하는데, 역상크로마토그래피에서는 용리 정도가 증가하도록 변한다. 이는 시간에 대해 이동상 중 유기 용매 비중이 증가하기 때문에 시료의 이동속도가 증가한다. 이와 같은 특성 때문에 resolution이 개선되고, separation efficiency가 증가하나, 이동상 조성이 변하기 때문에 상호 작용의 변화로 침전이 발생할 수 있다.

3) 이동상(용매)의 설정

이동상(용매)에 따른 분리의 특성이 변하므로, 특성을 고려하여 이동상(용매)을 결정하는 것은 중요하다. 이동상이 가져야 할 물리적 성질에는 검출이 용이해야 하며 점도 및 순도가 적당해서 이동이 잘 진행되어야 한다. 화학적 성질로는 이동상이 고정상을 녹이면 안되며, 시료 분자와 화학적 상호작용을 보이면 안된다. 또한 용매 세기를 잘 설정해야 한다. 설정한 용매가 complex일 때 용매의 부피 비율을 Fn, 각 성분의 고유한 용매 세기를 Sn이라고 할 때 전체 용매 세기를 얻을 수 있다.

다만, 용매 세기를 너무 높게 설정하면 고정상과의 상호작용이 크게 발생해 분리 자체가 발생하지 못하며, 너무 낮게 설정하면 고정상과의 상호작용이 거의 일어나지 않아 용매의 이동에 문제가 발생할 수 있다.

 

3. Chromatogram - 크로마토그래피 결과 분석

분석하고자 하는 크로마토그래피의 종류, 이동상/고정상 설정을 마친 후 실제로 분리를 진행하면 chromatogram을 얻을 수 있다. 크로마토그램을 이용하면 진행한 실험에 대해 몇 가지 정보를 얻을 수 있다. 이번 실험에서 사용하는 크로마토그래피는 액체크로마토그래피이므로 이를 기준으로 표현하겠다.

1) 용량인자, 크기인자 (Capacity factor k’)

용량인자는 이동상 및 시료가 고정상 (column)에 머무르는 정도를 표현한다. 이는 시료와 고정상이 얼마나 상호작용을 할 수 있는가를 표현하는 척도이다. 분리하고자 하는 시료의 성분이 column을 거쳐 분리된 상태로 용출되어야 하므로 서로 다른 용량인자 k’ 값을 보여야 한다. Capacity factor는 아래의 식과 같다.

 

Retention time은 시료마다 고유한 값을 갖는다. 또한 capacity factor의 값과 시료가 column에 머무르는 정도는 비례한다. 또한, capacity factor와 분리 정도는 비례하나, 그만큼 bandwidth W의 크기도 증가한다.

한편, Capacity factor는 column내에서 분배가 진행되는 과정 중 자유 에너지의 변화를 관찰할 수 있다. 이는 분배 계수(distribution coefficient)에 비례한다. 분배 계수는 이동상을 용매로 갖는 시료의 용해도에 대한 고정상을 용매로 갖는 시료의 용해도의 비 값을 말한다. capacity factor와 분배계수 사이의 관계를 수식으로 표현하면 다음과 같다.

이를 이용하면 capacity factor로 이동상 및 고정상에 들어있는 시료의 양을 표현할 수 있다. 이를 표현하면 다음과 같다.

k' 의 범위	시료 성분의 상대적인 농도
k'=0	시료가 고정상의 영향을 받지 않아 t0에 바로 시료가 용출이 됨
k'=1	시료가 2t0 지점에서 용출됨
1<k'<6	시료가 적당한 시점에서 용출됨

2) 선택성, 분리인자 (Separation or Selectivity factor, α)

selectivity factor는 분리하려고 하는 시료들에 대한 capacity factor의 비율이다. selectivity factor의 값이 1이면 두 시료가 분리되지 않음을 뜻하고, 1보다 클 때 두 혼합 시료가 분리되었다고 판단할 수 있다. α를 식으로 표현하면 다음과 같다.

3) 컬럼효율 (Column Efficiency)

column efficiency는 컬럼단이론(plate theory)를 이용해서 설명할 수 있다. 우선, 효율을 식으로 표현한 후 설명해보도록 하겠다. 여기서 N을 이론단수(Theoretical Plate Number)라고 하자.

N은 컬럼 효율의 척도를 표현하며, 주어진 실험 조건이 일정할 때 그 값은 거의 변하지 않는다. 해당 변수의 예시로는 이동상의 유속, 온도, 시료 주입의 조건 등이 있다. 컬럼효율은 시료가 컬럼을 통과하는 동안 발생하는 녹는 정도의 띠이며, 넓힘 현상의 정도를 말한다. 이는 이동상에 대한 분자들이 서로 다른 속도로 이동하며, 그 과정에서는 확산과 물질전달 등의 효과가 수반되기 때문에 관찰되는 현상이다.

한편, HETP는 Van Deemter Equation을 이용해서 표현할 수 있다. Van Deemter Equation은 다음 식을 따른다.

각 항이 갖는 의미에 대해 설명하며 HETP의 의미를 살펴보자.

 

A항은 소용돌이 확산(eddy diffusion) 효과를 표현한 식이다. (multiple paths term) 분자가 이동상을 따라 이동할 때 고정상과의 상호작용을 수반하는데, 이때 시료의 각각의 입자의 flow path는 달라진다. 이 경로의 차이는 시료들의 retention time에 영향을 미친다. 다만 이동상과 고정상을 그대로 유지하는 경우, 값은 일정하게 나타난다.

B항은 이동상에서 분자가 확산되는 정도를 의미하며, 이는 peak의 height가 커지는 정도를 의미한다. 용질은 고농도 지역에서 저농도 지역으로 이동하므로 띠의 중심에서부터 띠의 가장자리로 확산된다. 유속이 빠르면 그 정도가 감소하므로 반비례 관계를 보인다. 마지막으로 C항은 mass transfer의 정도를 의미한다. 이는 시료가 이동상과 정지상 사이에서 이동할 수 있는 정도를 의미한다. 만약 flow rate가 빨라지면 이동상-고정상 사이에서 평형이 발생하지 않고 시료가 이동하기 때문에 peak의 너비 W가 증가한다.

위의 A, B, 그리고 C항을 고려하면 column의 효율을 증가할 수 있다. (분리능 R의 조정)

① column의 길이를 증가시킨다. (다만, 지나치게 용리가 되지 않도록 조심해야 한다.)

② 이론적 column층의 높이 HETP의 높이를 줄인다.

한편 이론단수 N의 값도 효율을 표현할 수 있는데, 이는 다음과 같은 변수들에 의해 조정될 수 있다.

① column을 채우고 있는 입자의 크기를 줄일수록 N은 증가한다.

② flow rate과 N은 반비례관계이다. 즉, flow rate가 감소할수록 N은 증가한다.

③ 이동상의 점도가 낮아질수록 N은 감소한다. (점도와 N은 비례관계)

④ 이동상의 온도가 높을수록 N은 증가한다. (온도와  반비례관계)

⑤ 용질의 크기가 증가하면 N의 크기는 감소한다. (크기와 N은 반비례관계)

4) 분리도 (Resolution R)

이 척도는 주입한 시료가 최종적으로 용출될 때 column에 의하여 각 성분이 어느 정도로 순수하게 분리가 되었는지를 보여주는 척도이다. 이는 앞의 capacity factor, selectivity, 이론단수를 이용해서 정의한다.

이 식을 통해서 혼합 시료 내에서 설계된 크로마토그래피에 대해 비슷한 성질을 갖는 성분들이 분리된 정도를 표현한다.

위의 그림은 분리도 값에 따른 chromatogram을 표현한 것이다. 유사한 성질을 띠는 두 성질이 완전히 분리되었다고 판단할 수 있는 지점은 R=1.5이상일 때로 생각한다.

 

4. HPLC의 구성

HPLC는 이동상을 액체로 갖는 크로마토그래피이며, 분리가 빠르게 진행되도록 높은 압력이 필요하기 때문에 High Performance 또는 High Pressure Liquid Chromatography라고 한다. HPLC 기기는 다음과 같은 구성을 갖는다.

* 실험에서 사용한 HPLC의 특성을 표현하기 위하여 매뉴얼의 내용을 편집없이 그대로 기술하였다.

1) 이동상 저장기

이번 실험에서 사용하는 HPLC 기기는 하나 또는 그 이상의 저장기를 갖고 있으며, 이는 유리 또는 스테인레스 스틸로 구성되어 있다. 이 저장기에는 용해된 기체(일반적으로 산소)를 제거하는 장치가 붙어있다. 이동상에 공기가 녹아 있으면 기포가 발생하여 유속이 변하고 검출기의 성능을 떨어뜨리므로 사전에 제거해야 한다.

2) 펌프 장치

HPLC 펌프 장치는 이동상을 일정하고 재현성 있게 컬럼에 공급해야 하며, 아래의 조건에 부합해야 한다.

① 6000psi 까지 압력 발생이 가능해야 한다.

② 0.1∼10mL 사이의 흐름속도를 조절할 수 있어야 한다.

③ 펌프에서 나오는 용매의 공급은 펄스가 없어야 한다.

④ 펌프 내의 부분 장치는 부식되거나 용매와의 화학적 상호 반응이 없어야 한다.

⑤ 유속의 속도 및 유속의 재현성은 0.5 % 이내를 유지하여야 한다.

3) 시료 주입 장치

일정한 용매의 흐름에 대한 영향을 최소화하며 일정한 양의 시료를 주입하는 장치이다 시료의 주입은 용리 띠 현상 때문에 가능한 적게 주입하는 것이 좋다. 따라서 시료의 주입 부피는 가능한 작은 것이 좋다.

4) 컬럼

컬럼은 정지상을 충전한 좋은 분리관을 말한다. 컬럼의 재질, 모양 및 서로 다른 두 컬럼 사이의 연결 등이 분리에 매우 큰 영향을 미친다. HPLC 컬럼은 일반적으로 높은 압력이 필요하므로 이 압력에 견딜 수 있어야 한다.

5) 검출기

이상적인 검출기는 다음 특성을 갖추어야 한다.

① 높은 감도와 모든 분석 물질에 대해서 같은 감응도를 가져야 한다.

② 넓은 범위에서 선형적인 감응을 나타내야 한다.

③ 온도나 이동상의 흐름에 영향을 받지 않아야 한다.

④ 짧은 시간에 감응해야 한다.

⑥ 이동상이 감응하지 않아야 한다.

⑦ 용리 띠의 넓힘 효과가 없어야 한다.

⑧ 용질을 파괴하지 말아야 한다.

⑨ 신뢰도가 높고 사용이 편해야 한다.

Ⅳ. Chemicals & Apparatus

1. Chemicals

1) 400ppm R, T, X (용매 Acetonitrile 10mL + 시료 4 μl)

2) benzene, toluene, xylene, 미지시료 1, 미지시료 2

 

2. Apparatus

- HPLC

 

Ⅴ. Procedure

1. 기기 실행 및 연결 준비

1) HPLC 기기의 기계를 열어서 사용할 column의 연결이 되어 있는지 확인한다. (사용하는 column : 4.6 × 150mm C185μm column)

2) 사용하려고 하는 이동상(ACN : DW = 6:4)이 A번에 연결이 되어 있는지 확인 하고, 이동상이 400mL 이상 남아있는지 확인한다.

3) HPLC 기기의 Vacuum degasser, Quaternary pump, Column compartment, UV/Vis detector의 네 칸의 기기의 전원을 모두 작동한다.

4) 컴퓨터의 전원을 켜고 바탕화면에 있는 autochro-3000 프로그램을 실행한다.

5) 왼쪽 상단에 있는 분석목록을 누른 후 사용자 로그인을 한다. (비밀번호 없이 로그인) - 프로그램을 보면 사용자 로그인이 되어 있지 않기 때문에 왼쪽 하단을 보면 제어목록이 비활성화 되어있는 상태임을 확인할 수 있다.

6) 왼쪽 하단의 제어목록이 활성화되면, 제어목록으로 창을 전환한 후, 왼쪽 상단의 제어목록을 누른 후, 제어목록 열기 버튼을 누르고, 제어목록을 실행한다. 이때, 왼쪽 중앙 제어목록들 하단에 이미 실행되고 있는 제어목록이 있으면 우클릭을 하여 제어목록을 닫는다. (바탕화면 HPLC 폴더에 9100 file)

7) 연결이 될 때까지 기다린 후, 각 기기별 상태가 빨간색으로 뜨면, 화면 중앙에 실행되고 있는 제어 목록을 누른 후, 제어 목록 다시 열기 버튼을 누른다. 기기별 상태가 검은색으로 뜨고, 제어목록들 하단에 기기들의 연결이 완료되면 참조광량과 샘플광량이 50 이상의 값에서 안정화가 될 때까지 기다린다. (기기 이름 오른쪽에 ~ : 연결 되는 중, *: 연결 오류) (50 이하로 떨어질 경우 lamp의 교체가 필요하다.)

8) 분석 분비 버튼을 누르고, 기기 이름 오른쪽에 ~ 표시가 사라진 것을 확인한다.

9) PUMP를 더블 클릭하여 pump 창을 활성화하고, PUMP를 우클릭해서 추적그래프를 연다.

10) 연결된 이동상이 A 100% B 0% C 0% D 0%로 되어있는지 확인한 한다. (A번에 제대로 연결이 되어있는 지 확인) 하단 유속값에 0.3mL/mim을 넣은 후 적용 버튼을 누르고 작동 버튼을 누른다. PUMP창 상단의 상태에 유속 값이 변하는 지 확인한다.  

11) 이동상이 흐르고 있는 관에 있는 기포를 제거하기 위해 프라임 단계를 진행한다. Quaternary pump(HPLC 기기의 두번째 칸)에 있는 valve를 왼쪽으로 끝까지 돌린 후, 압력이 0으로 떨어진 것을 확인 한 후에, PUMP 창에서 프라임 시작 버튼을 누른다. 프라임이 제대로 진행되고 있는지는 valve안에 있는 기포가 움직이는 것으로 확인할 수 있으며, 소리로도 확인할 수 있다.

12) 프라임을 30초 정도 진행한 후에 프라임 중지 버튼을 누르고, 왼쪽으로 끝까지 돌렸던 valve를 다시 오른쪽으로 끝까지 돌려서 잠근다.

13) 잠시 후 다시 압력이 올라가는 것을 확인하고, 추적그래프에서 압력이 stationary state이 되면, 압력을 0.8mL/mim으로 올린다.

14) 그 이후 0.2mL/mim의 압력을 더 올려 1.0mL/mim까지 올린다.

15) 유속이 1.0mL/mim인 상태에서 압력이 1500~2000psi 사이의 값에서 일정해지는지 확인한다. (유속 1.0mL/mim으로 올린 후, 8분 정도 유지해서 확인) 압력이 일정해지면 sample을 분석할 준비를 한다.

 

2. Sample 시료 분석 방법

1) 프로그램 창 중앙에 시료 목록에 기존에 사용되었던 시료목록이 기입되어있으면, 모두 삭제한다.

2) 시료 목록 창에 우클릭을 하여 시료 추가버튼을 누른다.

3) 시료 이름, 파일 이름, 시료 ID 값에는 분석하고자 하는 시료의 이름을 넣는다.

4) 제어방법버튼을 누르고, 찾기 버튼을 누른 다음 HPLC 폴더 안에 있는 ‘화공기초실험 HPLC 제어 min’을 모두 넣는다.

5) 분석목록 버튼을 누르고, 찾기 버튼을 누른 후, ‘화공기초실험 HPLC 7min’ 폴더를 열고 해당 그룹 폴더 안에 파일 이름을 넣고 열기 버튼을 누른다. 분석목록 파일 이름대로 새 파일이 생성된다.

6) 후처리 목록을 적분으로 설정한다.

7) Syringe에 시료를 넣고 (모든 시료는 30μL), syringe안에 기포가 없는지 확인해야 한다. 기포가 있으면 syringe 안의 시료를 버리고, 다시 syringe에 시료를 넣는다. (이때, syringe의 종류와 sample의 종류가 섞이지 않도록 주의한다.)

8) 기기 오른쪽 부분의 injection valve를 왼쪽 (load)로 돌린 후, syringe 바늘을 끝까지 넣은 후 injection한다. 그 후 valve를 오른쪽(inject)으로 돌리게 되면 분석이 시작된다.

9) 마찬가지로 모든 시료를 분석한다. (CAN, benzene, toluene, xylene, 미지시료1, 미지시료2)

 

3. 결과 분석 방법

1) 분석목록에 들어가서 분석하고자 하는 sample을 선택한다. (왼쪽 상단 분석목록 -> 열기 -> 파일) 또는 제어목록에서 이미 완료된 sample을 더블클릭한다.

2) Shift키를 누르고 peak 처음부터 끝까지 드래그 한 후 적분 초기화를 한다.

3) 원하는 peak를 shift키를 눌러서 드래그 한 후 강제 피크를 선택하여 면적을 구한다.

4. 종료 방법

1) 유속을 0mL/min으로 맞춘 후, 압력에 0psi에 도달하면 정지한 후, HPLC 프로그램을 끄고, 바탕화면 오른쪽 하단에서 usb를 제거하듯이, 프로그램 연결해제를 한 후에, HPLC 기기를 위에서부터 차례대로 종료한다.

2) 컴퓨터를 종료한다.

3) 흘러나온 이동상을 폐기물통에 버린다.

Ⅵ. Data & Result

 

2. 정량적 Data 분석

1) 정보정리

	머무름 시간 RT (min)	면적 (mV*sec)	면적비 (%)
Benzene (B)	4.0750	626.4771	100.00
Toluene (T)	5.7100	935.0903	100.00
Xylene (X)	*8.4233	775.9974	100.00

 

* Xylene의 RT는 가장 peak를 기준으로 고려했다. 구체적인 이유는 Discussion에서 다루겠다.

		머무름 시간 RT (min)	면적 (mV*sec)	면적비 (%)
미지시료1	**1st peak	4.0767	360.6497	52.44
	2nd peak	8.4250	327.1414	47.56
미지시료2	1st peak	4.0800	242.0078	38.14
	2nd peak	5.7150	392.5988	61.86

 

** RT를 고려하면 미지시료의 1st, 2nd peak를 표준시료의 혼합물로 생각할 수 있으며, 각 peak가 어떤 물질의 peak인지도 알 수 있다. 마찬가지로 구체적인 설명은 Discussion에서 다루겠다.

	1st peak	2nd peak
미지시료 1	B	X
미지시료 2	B	T

 

2) capacity factor k'  (용량인자)

'= t1R - t0 t0

- 이동상의 머무름 시간이 수치로 제시되지는 않았으나, geogbra로 좌표를 설정하여 내분 비율로 각 분석에 대한 t0 를 얻을 수 있다.    (t1R : 시료의 머무름 시간 t0 : 이동상의 머무름 시간)

	t0  (min)	t1R  (min)	'
B	1.0562	4.0750	2.8582
T	1.0883	5.7100	4.2467
X	1.0959	8.4233	6.6861
미지시료 1	1.0618	4.0767	2.8394
미지시료 2	1.1012	4.0800	2.7050

 

3) Selectivity factor α (선택성)

α= t2R - t0 t1R - t0= t2'Rt1'R= k2'Rk1'R

- B-T/T-X/X-T에 대한 α와 미지시료의 α를 얻을 수 있다.

	k2'R  (min)	k1'R  (min)	α
B-T	4.2467	2.8582	1.4858
T-X	6.6861	4.2467	1.5744
X-B	6.6861	2.8582	2.3393
미지시료 1 (B, X)	6.9346	2.8394	2.4423
미지시료 2 (B, T)	4.1898	2.7050	1.5489

 

3) 이론단수 N과 이론단 높이 H

- 이론단수는 실험 데이터에 제시되어 있으나 아래의식을 통해서 계산할 수 있다.

N=16tRWb2=5.54tRW1/22

Wb : peak 최하단 부분의 길이 W1/2 : Wb 의 절반

- 4.6 × 150mm C18 5μm column을 사용하므로 컬럼의 길이는 150mm로 두고 계산을 진행했다.

HETP (H)=LN

 

 

		이론단수 N	이론단 높이 H (mm)
B		6404.3	0.023422
T		8769.0	0.017106
X		8446.6	0.017758
미지시료1	1st peak	6850.1	0.021897
	2nd peak	8112.7	0.018490
미지시료2	1st peak	8618.3	0.017405
	2nd peak	10081.0	0.014880

 

4) Resolution R (분리도)

Rs=∆tW=2∆tWA+WB

- 혼합시료가 순수하게 분리된 정도를 분석하는 것이므로, 미지시료에 대해서만 분석하면 된다.

	WA  (sec)	WB  (sec)	∆t  (min)	Rs
미지시료 1	11.82	22.44	4.3483	15.23
미지시료 2	10.55	13.66	1.635	8.104

 

 

6) 미지시료 구성과 농도 구하기

- sample에 포함되어 있는 시료의 부피

30μL×4×10-64×10-6+10×10-3=0.011995⋯≈0.01200μL

- ‘미지시료에 포함되어 있는 부피 : 면적 = sample에 포함되어 있는 시료의 부피 : 면적’을 계산하여 미지시료에 포함되어 있는 B, T, X의 양을 결정짓는다.

- 시료의 양이 적으므로 아세트아마이드 : 증류수 = 6 : 4의 평균 밀도를 이용해서 각 시료의 질량비를 계산한다. (모두 약분되므로 부피비의 비율을 이용해도 무방하다.)

		부피 (μL)	질량비
미지시료 1	B	6.908×10-3	0.5773
	X	5.059×10-3	0.4227
미지시료 2	B	4.636×10-3	0.4792
	T	5.038×10-3	0.5208

Ⅶ. Discussion

1. RT 해석

RT는 크로마토그래피 중 처음으로 시료가 검출이 되는 데 걸리는 시간을 의미한다. 이는 RT를 알면 컬럼에서 시료가 이동하는 속도를 비교해볼 수 있다. 표 3에서 B, T, X순으로 RT가 더 빠른 것을 확인할 수 있다. B를 기준으로 T와 X는 각각 메틸기가 1개, 2개가 치환되어 있는 형태이므로 분자의 크기가 커질수록 이동상에서 시료가 더 움직이기 힘들다는 결과를 알 수 있다. 다만, 그림 9에서 X는 같은 물질임에도 불구하고 3개의 peak가 관찰된다. 이는 X가 T를 기준으로 메틸기가 붙은 자리에 따른 이성질체가 존재할 수 있기 때문이다.

각 peak와 xylene을 대응하려면 HPLC의 이동상과 고정상에 대해 살펴보아야 한다. HPLC는 무극성의 고정상을 사용하며, (물+아세트아마이드)인 극성인 이동상을 사용하기 때문에 역상크로마토그래피라고 할 수 있다. 그렇기에 극성이 큰 물질일수록 이동상과의 상호작용이 고정상보다 증가하기 때문에 빨리 검출된다. X의 이성질체 중 메틸기가 서로 대칭으로 있는 p-xylene이 가장 작은 극성을 가지며, o-xylene은 가장 큰 극성을 갖는다. 따라서 그림 9에서 보이는 3개의 peak는 빨리 검출되는 순서대로 p-xylene, m-xylene, o-xylene이며, RT는 o-xylene을 기준으로 측정한 것임을 확인할 수 있다. 한편 B, T, X의 검출속도와 X의 이성질체의 검출 속도를 통해서 분자의 크기와 극성여부가 검출 속도에 영향을 주는 정도를 비교할 수 있다. 극성은 B, T, X순서로 증가하는데, 분자의 크기도 같은 순서대로 증가한다. 하지만 가장 무극성을 띠며 크기가 작은 B가 제일 빨리 검출이 되는 것으로부터 분자의 크기가 분자내 극성여부보다 더 주요한 영향을 미치는 것을 알 수 있다.

한편, RT의 상대적인 비교로 미지시료를 구성하고 있는 표준 시료들을 결정해야 미지시료가 포함하고 있는 물질의 조성을 구할 수 있다. 미지시료가 표준시료들의 혼합물이라는 것을 생각했을 때 mixture이기 때문에 상호작용을 감안하더라도 RT의 값이 비슷하게나마 관측이 되어야 하며 비교 결과 미지시료 1은 B, X 미지시료 2는 B, T로 구성되어 있는 것을 알 수 있었다. 그리고 peak의 면적 사이의 비율을 이용하면 실제 포함되어 있는 시료들의 부피를 구할 수 있다. 면적을 구성하는 정보는 시간과 전위차다. 같은 물질에 대해서 발견되는 전위차는 거의 유사할 것이므로 peak의 길이가 물질의 양을 결정지을 수 있다. 이에 실험에서 사용한 sample의 부피와 이동상과 표준시료 사이의 부피비를 고려하여 표준 시료의 부피와 그에 따라 관측되는 면적의 비를 구해서 물질의 양을 결정지었다. 부피는 온도, 압력 등에 의해서 영향을 많이 받기에 이를 solvent dry basis를 기준으로 미지시료의 질량 조성을 표현할 수 있었다.

2) 용량인자 분석

용량인자는 분석 sample이 구성하고 있는 각 성분이 column에서 머무는 정도를 표현한 것이다. 표 6에 해당 결과를 정리했으며 B, T, X 순서대로 용량인자가 증가하는 것을 확인할 수 있다, 이는 RT에서 설명했던 것과 같이 분자의 크기가 증가할수록 이동하는 정도가 감소하여 column에 더 오래 머무를 수 있기 때문이다. 용량인자는 peak의 위치 뿐만 아니라 실제 정량적인 계산을 통해서 구할 수 있다. 이는 이동상이 이동하여 peak가 관찰되는 시간과 그 후로 시료가 검출되기까지 걸린 시간의 비율을 구하면 된다. 제공받은 자료에서는 시료에 대한 시간만 나와있어서 이동상의 peak가 나타나기까지 걸린 시간을 따로 구할 필요가 있었다. 제공받은 그림을 geogbra에 옮겨 시작점, 이동상 검출 시점, 시료 검출 시점 사이의 비율을 구한 후 시작점과 시료 검출 시점에 대해 비율을 갖는 이동상의 검출 시점을 구할 수 있었다. 이론상으로는 같은 실험 환경에서는 이동상의 검출 시간은 동일해야 한다. 하지만, 실제 구해본 결과 이동상의 검출 시간에는 약간의 오차가 있었다. 이는 순수한 이동상이 이동하는 것이 아는 혼합물이 column을 따라 이동하기 때문이다. 그리고 기기가 실험 환경을 잘 조성했을 것이지만, 약간의 설정 오차가 발생하여 검출 시 차이가 발생했을 수 있다. 그리고 용량인자의 값을 통해서 용출의 적합성을 판단할 수 있다. 표 6을 확인해보면, 용량인자 중 가장 작음 값이 2.7050으로 이 수치는 1보다 크다. 그러므로 모든 시료가 적절하게 용출이 되었다고 판단할 수 있었다.

3) 선택성 분석

선택성은 mixture인 경우 peak가 얼마나 잘 분리되었는가를 비교하는 것이다. 이는 두개 이상의 peak가 갖는 용량인자의 비율을 계산해서 얻을 수 있다. 이번 실험에서 살펴봐야 할 mixture은 미지시료와 표준시료 중 X이다. 우선, 미지시료를 판단하기 위하여 표준시료 사이의 선택성과 실제 미지시료 사이의 선택성을 구하고 이를 표 7에 정리했다. 이상적인 mixture이라면 표준 시료 사이의 비율과 실제 미지시료의 비율은 동일해야 한다. 하지만 실제 측정 결과 그렇지 못했다. (애초에 표준 시료에 대한 정보들의 측정이 정확하지 못할 수 있지만 해당 가능성을 배제하고 설명하겠다.) 해당 현상을 설명할 수 있는 것은 사용한 sample이 실제로는 ideal solution이 아니라는 것이다. B, T, X 모두 탄화수소이므로 무극성 전자구름을 갖는 영역이 존재하여 시료 사이의 상호작용이 존재한다. 이는 표준 시료만 있을 때와 달리 상호작용으로 용출 시간이 영향을 받을 수 있다. 부수적인 이유로는 크로마토그래피 running 환경에 약간씩 차이가 났다는 점을 들어볼 수 있다. 그리고 X의 peak에 대해 살펴보자. 실제 선택성을 계산을 하지는 않았으나 그림 9를 보면 비교적 peak가 겹쳐져서 나타나는 것을 확인할 수 있다. 이는 이성질체가 서로 상호작용을 통해서 하나의 X 처럼 거동을 했기 때문이다. 정제 방법 등을 사용해서 한 가지 X를 사용하거나 분리도를 더 좋게 실험 환경을 설정하면 보다 나은 실험 결과를 얻을 수 있을 것이다.

4) 이론 단수 (N)와 이론단 높이 (H) 분석 + 더 높은 효율의 크로마토그래피 running 방법

이론 단수와 이론단 높이는 컬럼의 효율을 보여주는 대표적인 지표이다. 이론단수와 이론단높이는 식을 통해서 계산할 수도 있으나 실험 결과에 해당 지표가 표현되어 있었기 때문에 이론 단수는 직접 계산하지 않았다. 그리고 기기의 정보를 통해 사용한 column의 길이를 이용해서 H를 계산할 수 있었다. 이동상의 유속, 온도, 시료 주입 조건 등 실험 환경이 동일하다면 해당 값은 거의 변하지 않아야 한다. 표 8에 정리된 정보를 보면, 표준 시료 형태일 때의 N과 미지시료를 구성하는 각 성분일 때의 N이 차이를 보이는 것을 확인할 수 있다. 해당 원인을 Van Deemter Equation을 통해서 살펴보자.

HETP=A+B/μ+Cμ

이동상의 속도 μ 가 일정하다고 했을 때 소용돌이 확산 정도 A, 이동상에 시료가 확산되는 정도 B, 물질 전달 정도 C를 통해서 생각해볼 수 있다. 우선 같은 이동상과 고정상을 사용하므로 A에 대한 차이는 거의 발생하지 못한다. B는 peak의 높이를 나타내는데, 해당 결과 데이터를 보면 표준 시료들과 미지시료에서의 height에서는 거의 차이가 발생하지 않음을 확인할 수 있다. 즉 미지시료에서 C의 차이가 발생했기 때문에 값의 차이가 발생했다고 할 수 있다. C는 시료가 이동상 - 정지상 사이에서 이동할 수 있는 정도를 뜻하는데, mixture인 경우 해당 상호작용에 영향을 받을 수 밖에 없다. 다만 실험을 1번만 진행했기 때문에 N의 증감 경향성이 들쑥날쑥하며, 정확한 경향성은 확인할 수 없었다.

한편, N의 값을 조정함으로써 column의 효율을 증가시킬 수 있다. 첫 번째로 column의 길이를 증가시켜서 시료 사이의 분리가 더 잘 진행되도록 한다. 하지만 column의 길이를 가하는 압력, 이동상의 속도가 수용하지 못할 정도로 증가시킨다면 이동상에 시료가 필연적으로 혼합되기 되기 때문에 pure한 이동상을 사용하지 못하게 되며 되려 분리 효율을 떨어트릴 수 있다. (mixture의 entropy에 대해서 두 물질의 극성이 다르더라도 소량에 대해서는 무조건 혼합이 가능하기 때문이다.) 그리고 column을 채우고 있는 입자의 크기를 줄여서 더 균일하고 표면적이 증가한 상황에서 running을 진행하면 효율이 증가한다. 또한 이동상의 온도를 높이고, 점도를 낮추어서 효율을 높일 수 있다. 그리고 기기상의 문제가 아닌 실험자가 지나치게 크거나 분자구조가 긴 sample을 running하지 않아 자체적으로 더 높은 분리 효율을 얻을 수 있다. 그리고 시료를 넣을 때 공기가 유입되지 않도록 해야 한다. 이는 같이 주입된 공기에 포함되어 있는 물질 등이 농도에 영향을 줄 수 있으며 심지어 불필요한 peak를 얻어내는 데에도 영향을 주기 때문이다. 그리고 running 도중 압력을 일정하게 유지시켜 마찬가지로 압력차에 의해서 발생하는 불필요한 peak가 발생하지 않도록 조정할 수 있다.

5) 분리도 분석

결국 크로마토그래피는 미지 시료를 분석하고 정량적 수치를 얻어내고자 하는 정제과정이기 때문에 효율은 혼합물들을 잘 분리하는 지표를 나타내는 분리도와 직결된다. 분리도는 앞서 구한 용량인자. 선택성, 이론단수를 이용해서 구할 수 있으나. mixture에 대해서 해당 수치들의 기준을 잡는 것이 애매하다. 이에 혼합물을 구성하고 있는 peak 너비의 평균과 구성하고 있는 시료들이 각각 분리될 때 까지 걸리는 시간 사이의 비율을 이용해서 분리도를 구할 수 있다. 그림 6에서 분리도의 수치에 따른 peak의 분리 정도를 확인할 수 있다. 이번 실험 결과 미지시료 1과 2의 분리도는 각각 8, 12이상이므로 분리가 잘 되었다고 판단하는 기준값인 1.5보다 매우 큰 것을 확인할 수 있다. 즉, 분리가 잘 되었다는 것으로 판단이 가능하다. 하지만 표준시료 X의 분석 결과를 보면 peak가 완전히 분리되지 못한 것을 확인할 수 있다. 만약 해당 peak들에 대해서 분리도를 계산하면 1.5보다는 작은 값들을 얻을 수 있다고 예상 가능하다.  

Ⅶ. Reference

1. 서강대학교 화공생명공학기초실험1 매뉴얼 2020

2. 오도석, CHROMATOGRAPHY 1st reviced edition, 학술편수관, 2012. pp. 13~15, 82~85