크로마토그래피(Chromatography)

 

 

Ⅰ. Title

크로마토그래피(Chromatography)

 

Ⅱ. Purpose

1. 정상, 역상 크로마토그래피를 이해하고, 이동상과 고정상의 개념을 배운다.

2. TLC와 Columm 크로마토그래피로 색소를 분리함으로써, 크로마토그래피의 원리와 극성의 개념을 배운다.

 

Ⅲ. Theory

1. 혼합물의 분석과 분리

분석 화학에서는 혼합물에 대한 화합물을 직접 분석하는 방법이 있다. EDTA 적정 혹은 각종 분광법이 이에 해당한다. 하지만 불가피하게 혼합물을 직접 분석하지 못하면 분석 물질을 구성하는 각각의 화합물로 분리하는 과정이 꼭 필요하다. 혼합물의 조성 물질의 성분 및 상태에 따라 거름, 증류, 확산, 침전 등을 통해 분리할 수 있다. 그러나 최근에는 크로마토그래피(chromatography)를 통해 혼합물을 분리하는 경우가 많다.

 

2. 물질의 극성과 상호작용

화학결합은 전자의 상호작용으로 인해 발생한다. 결국 어떤 결합을 이루고 있는 물질에 대해서 전기음성도 차이가 극성을 결정하는데 큰 요인으로 작용할 수 있다. 두 원자사이의 전기음성도 차이로 인해서 극성 결합이 형성될 수 있다. 반면 두 원자사이에 전기음성도 차이가 없다면 이는 무극성 결합을 형성한다. 다만 극성 공유 결합이 존재한다고 해서 항상 그 물질이 극성을 갖는 것은 아니다. 원자가 3개 이상 존재할 때 극성 공유 결합을 가지고 있더라도 분자의 구조에 의해서 쌍극자 모멘트가 상쇄되어 전체 쌍극자 모멘트 값이 0을 나타낸다면 이는 무극성 분자이다. 한편, 극성 결합이 있으면서도 기하적 구조가 대칭이 아니라면 알짜 쌍극자 모멘트는 0이 아니며 이는 극성 분자일 것이다. 용질과 용해의 관점에서 엔탈피의 변화 등으로 같은 극성을 갖는 물질이 서로 잘 섞이는 현상을 알 수 있다. 이를 확장하면 물질 사이의 상호작용에도 적용할 수 있다. 분자의 상호작용이 쌍극자 - 쌍극자 모멘트 인력이 분산력보다 더 강한 것을 알 수 있다. 이는 같은 극성을 갖는 물질들끼리 더 강한 상호작용을 하는 것을 알 수 있다. 이는 특히 용해도의 차이를 이용해서 물질을 분리하는 분리 방식 크로마토그래피에서 물질의 분리할 수 있는 주요 원리로 기인하며 TLC에서 전개제를 형성할 때 중요하게 고려되기도 한다.

 

3. 크로마토그래피 (chromatography) 분류와 실험에 해당하는 크로마토그래피 고찰

크로마토그래피를 딱 한마디로 정의하기는 어렵다. 왜냐하면 각 크로마토그래피 기법을 이용해서 혼합물을 분리할 때 주로 사용하는 원리가 다양하기 때문이다. 예를 들어 이동상의 종류를 기준으로 분류하면 액체, 고체 및 기체 크로마토그래피로 분류할 수 있다. 이제 크로마토그래피를 주로 사용하는 원리를 기준으로 분류해보자.

① 흡착 방식 (Adsorption mode): 분리를 위해 충전한 흡착제의 표면에 활성 자리(active site)가 존재한다. 시료가 이동상과 함께 흡착제를 지나갈 때 시료가 선택적으로 활성자리에 흡착된다. 이동상 속의 시료와 활성자리 사이의 수소결합 등 인력과 관련된 상호작용으로 흡착이 발생한다. 시료의 구조 혹은 극성 또한 흡착 여부에 큰 영향을 미친다. 액체-고체 크로마토그래피 혹은 기체-고체 크로마토그래피에서 주로 사용한다.

② 크기 배제 방식 (size exclusion mode): 정지상으로 사용한 다공성 겔이 갖는 물리적 특성을 이용한다. 겔에 의해 발생한 공간사이로 시료를 통과하게 한다. 이때 통과하는 시료의 크기가 작을수록 겔 사이의 틈새에 잘 끼어 이동하기 어려워지는 특성을 이용하여 물질을 분리한다.

③ 친화 크로마토그래피 (Affinity chromatography): 크기가 큰 분자의 분리와 정제를 위해서 다양한 흡착제를 개발하면서 발견했다. 원리는 흡착 크로마토그래피와 유사하며 대게 생물학적 특이성이 부여되어 있다.

④ 분배 방식 (partition mode): 시료 분자들의 이동상과 정지상에 대한 상호작용(용해도)의 차이를 통해서 시료 분자들을 분리한다. 여기서 이동상은 시료와 함께 흐르는 물질을 의미하며, 정지상은 멈추어 있는 물질을 의미한다. 분배 방식의 진행 속도는 앞선 카페인 추출 실험에서 고려했던 분배 계수(distribution coeffeicient)를 이용해서 논의한다. 어떤 물질에 대해서 이동상에 대한 용해도를 Cm, 고정상에 대한 용해도를 Cs라고 하자. 이때 분배계수 K=Cs/Cm으로 정의된다. 고정상이 흐르지 않는 물질, 이동상을 흐르는 물질로 사용하므로 물질의 용해도가 이동상에 대해 높을 때 보다 분리가 빠르게 발생한다. 즉 분배계수의 값이 클수록 이동상에 대해 물질이 쉽게 용해됨을 의미하고 더 빠르게 분리를 할 수 있음을 알 수 있다. 반면 분배계수의 값이 작다면 고정상에 대해 물질이 용해될 수 있으므로 분리가 천천히 일어난다. 혼합물 속의 각 물질들이 서로 다양한 분배계수 값을 가지기 때문에 물질의 분리가 발생한다. 하지만 그렇다고 이동상을 매우 강한 극성 혹은 무극성 물질을 사용하면 안된다. 왜냐하면 극성을 한편으로 치우치게 한다면 자칫 시료에 포함되어 있는 물질조차 용해시키기 못하고 비효율적인 분리 결과를 얻을 수 있기 때문이다. 분배 방식을 이용한 크로마토그래피는 사용하는 용액의 극성에 따라 정상 크로마토그래피와 역상 크로마토그래피로 구분할 수 있다. 이 두 크로마토그래피의 특성을 밑의 표를 통해서 정리해보도록 하자.

	정상 크로마토그래피	역상 크로마토그래피
고정상 극성	높음	낮음
이동상 극성	비교적 낮음	비교적 높음
시료성분의 용출순서	무극성일수록 빠르게 용출	극성일수록 빨리 용출
이동상의 극성을 높인 경우 용출속도	용출되는 속도가 늦어짐 (분배계수가 작아짐)	용출되는 속도가 빨라짐 (분배계수가 커짐)

분배 크로마토그래피의 경우 칼럼(관)을 이용해서 분리하는 경우가 많다. 이 경우, 시료를 위에서 아래로 분리한다. 분리 과정을 방치하더라도 중력에 의해 시료가 밑으로 내려오면서 분리가 진행된다. 하지만, 위에 압력을 가하면 감압 여과와 같이 압력 차를 이용하면 더 빠르게 용액을 분리할 수 있다. 한편, 분배 방식이 물질에 대한 용해도에 대해 논의하는 것을 보아 한가지 주의해야 하는 것을 알 수 있다. 분배 방식을 이용한 크로마토그래피를 진행하면 한 가지 시료에 대해서만 분리가 가능하며, 다른 분리를 위해선 새롭게 장비 설치를 해야 한다. 왜냐하면 분배계수가 무한의 값을 가지지 않다는 것은 일정량의 시료가 고정상에 용해될 수 있음을 의미하며 이는 고정상의 오염이 발생한다는 것을 의미한다. 따라서 이번 실험처럼 2가지 이상의 시료를 분리해야 하는 경우 각각의 분리마다 새롭게 크로마토그래피 장치를 만들어야 한다. 이번 실험 2에서 이용하는 크로마토그래피는 극성 물질인 실리카겔을 고정상으로 사용하는 것으로 보아 정상 크로마토그래피인 것을 알 수 있다. 무극성에 가깝지만 극성부위(-OH)도 가지고 있는 butanol을 이동상으로 하여 혼합물의 물질을 모두 용해할 수 있으며 정지상에 대해 뚜렷한 용해도 차이를 보여 보다 효과적인 분리를 진행할 수 있도록 했다. 효과적으로 분리를 진행하기 위해서 칼럼을 올바르게 준비해야한다. 칼럼에 채우는 충진제의 크기가 균일하고 건조되지 않은 상태를 유지하는 것이 중요하다.

⑤ 얇은 층 크로마토그래피 (thin layer chromatography): 얇은 층 크로마토그래피는 플라스틱 혹은 알루미늄을 지지체로 하여 실리카겔이나 알루미나를 정지상으로 얇게 표면에 코팅한 제품을 이용해서 진행한다. TLC에서 효과적을 물질을 분리하기 위해서 여러 수칙을 지켜야한다. 우선 시료는 주사기나 모세관같이 적은 양을 이동할 수 있는 도구를 이용해서 다른 시료 혹은 표준 물질에 대해 분명히 구분할 수 있도록 떨어트려야 한다. 또한 이동상(전개제)에 시료가 닿아 오염되는 일이 없도록 액체의 표면보다 높은 위치에 시료를 떨어트린다. TLC는 단면과 분배계수가 전개 거리에 대하여 일정하지 않다. 전개되며 이동하는 시료의 양도 달라지기도 하며 표면이 완벽하게 균일하지 않는 등 여러 이유가 있기 때문이다. 그래서 TLC 결과 분석에서는 억제 인자 Rf를 이용해서 분석하고자 하는 시료의 극성을 분석한다. 억제 인자는 동일 온도 하에 전개제의 상태가 균일하고 흡착제(얇은 판)의 두께가 일정하며, 분석시료의 양이 동일하면 반복된 실험에도 같은 값을 갖는다 전개 시작 지점으로부터 이동한 이동상(전개제)의 거리를 dM, 시작 지점에서 이동한 용질의 중심까지의 거리를 dR이라고 하자. 이를 이용하면 Rf값을 다음과 같이 정의할 수 있다.

\[R_f=\frac{d_R}{d_M}\]

TLC 크로마토그래피에서 사용하는 판은 실리카겔 등 얇게 코팅되어 있으므로 표면은 극성을 보인다. 만약 억제 인자 값이 크다면 표면에 대한 용해도가 낮아 전개제를 따라 많이 이동할 수 있는 것이므로 극성이 작은 것을 의미한다. 반면 극성이 큰 물질에 대해서는 억제 인자 값이 작게 나올 것이다. 왜냐하면 극성 표면에 의해서 전개제가 이동하는 것만큼 시료가 분자간 인력 때문에 쉽게 나아가지 못하기 때문이다. TLC의 결과를 유의미하게 얻기 위해서는 적당한 전개제를 제조하는 것이 중요하다. 각 실험에 대한 최적의 전개제는 실험에 의한 결과 비교로 정할 수 있다. 우선 용매강도에 대해서 고려해야 한다. 용매강도는 고정상에 대해 용매(전개제)가 얼마나 상호작용하는가를 의미한다. 정상 TLC에 대해서 실리카겔로 코팅된 표면에 의해 극성인 물질이 더 강한 용매강도를 보인다. 사용하는 용매의 부피 비율을 Fn, 각각의 용매 강도 인자를 Sn이라고 했을 때, 전체 용매 강도는 다음과 같이 얻을 수 있다.

\[S=F_1 S_1+F_2 S_2+\cdots \]

하지만 용매강도가 너무 크다면 고정상과 결합하고자 하는 경향이 커 효과적인 분리가 일어나지 않는다. 하지만 용매강도가 너무 작다면 고정상에 대한 흡착력이 지나치게 작아 용매가 얇은 판을 타고 올라가지 못해 분리를 못한다. 이 때문에 고정상에 대해 큰 용매강도와 작은 용매강도를 갖는 용매를 적절히 섞어 효과적으로 분리할 수 있는 전개제를 얻을 수 있다. 한편 시료가 각 성분으로 분리될 때 전개제를 타고 분리된다. 이때 ‘꼬리 끌림’현상이 발생할 수 있다. 만약 꼬리 끌림 현상이 발생한다면 정확한 전개 거리를 측정할 수 없으므로 약간의 아세트산이나 수용성 암모니아를 가해서 이 현상이 발생하는 것을 방지한다. 실제로 이번실험에서 사용하는 전개제도 용매 강도가 낮은 Butanol과 강도가 큰 정제된 증류수, 그리고 꼬리 끌림 현상을 방지하기 위한 아세트산을 적절한 비율로 섞어서 사용한다. 다만, 전개제를 만들 때는 정제된 증류수를 사용하는 것이 보다 올바른 수치를 얻게 도움을 준다. 왜냐하면 일반 수돗물을 사용할 경우 소독하기 위해서 사용한 약품들이 극성여부를 포함하여 전개제에 어떠한 영향을 주는지 예측할 수 없기 때문이다.

 

Ⅳ. Chemicals & Apparatus

1. Chemicals

물질 이름	화학식	화학식량(g/mol)	밀도(g/mL)	녹는점(℃)	끓는점(℃)
Methanol	CH3OH	32.04	0.792	- 97.6	64.7
Acetic acid	CH3COOH	60.05	1.049	16.2	117.5
1-Butanol	CH3(CH2)3OH	74.12	0.81	- 89.8	117.7
Silica gel	SiO2	60.08	2.65	1710	2230

적색색소, 청색색소, 황색색소, de-ionized water(D.I.W)(초순수)

2. Apparatus

TLC Plate, 10mL 주사기, 10mL 메스실린더, 모세관, 500mL 비커, 100mL 삼각 플라스크, Pasteur pipette, 저울, 솜, Spatula, 시계접시

 

Ⅴ. Procedure

실험 1. TLC판에 의한 색소의 분리

1. TLC 판 아래 (일자로 반듯한 부분)에서 1.0cm 간격을 연필로 밑줄 긋고, 약 1cm 간격으로 5개의 점을 찍는다.

2. 적색색소, 청색색소, 황색색소, 미지시료A, 미지시료B를 모세관에 묻혀서 점 찍은 곳에 찍는다.

3. 전개재 (Butanol : Acetic acid : D.I.W = 60 : 15 : 25)를 500mL 비커에 약 0.5cm 정도 (TLC의 점이 잠기지 않을 정도)로 붓고, TLC 판의 색소가 퍼지지 않도록 조심스럽게 넣은 후, 시계접시로 덮어준다.

4. 약 1시간 후 TLC 판을 꺼내고 전개제가 이동한 거리를 연필로 표시 후 말리고, 각 색소가 이동한 거리를 표시 후, Rf값 측정 값을 계산하고 사진 촬영을 한다. (소수점 아래 두자리까지)

 

실험 2. 컬럼 크로마토그래피를 이용한 색소 분리

1. 10mL 주사기에 솜을 얇게 깔아주고, Silica gel을 주사위 눈금 7mL까지 넣어준다.

2. 주사기 12mL 눈금까지 Butanol을 넣고 Silica gel이 완전히 적셔질 때까지 기다린 후, 100mL 삼각 플라스크를 주사기 아래에 받치고, 피스톤을 조금만 밀어 넣어 압력을 가하며 Butanol을 흘려서 보낸다.

3. Butanol이 충진제 가장 윗부분을 여유 있게 적셔줄 정도까지 확인하며 흘려서 보낸다. (주의: 피스톤 검정부분만 조금만 넣었다 뺐다를 반복하여, Silica gel 사이에 기포가 생기지 않도록 한다. Butanol을 충진제 눈금에 정확히 맞추어 흘려보내면 Silica gel이 마르므로 주의한다.)

4. 미지시료 A를 충진제 윗부분을 모두 덮을 정도로 넣어준다.

5. 피스톤으로 살짝 눌러 미지시료를 충진제의 적셔준 후, Butanol을 주사기 눈금 10mL 정도까지 채우고 피스톤을 5분 간격으로 아주 조금씩 눌러준다.

6. 용리액(Butanol)을 서서히 흘려주면서 색소가 분리되는 것을 관찰하고, 사진촬영을 한다.

7. 미지시료 B를 1)~6) 과정을 거쳐 분리하고, 사진촬영을 한다.

 

Ⅵ. Data & Result

실험 1. TLC에 의한 색소 이동거리와 Rf 값

	이동 거리	전개제 이동 거리	Rf
적색 색소	1.40	4.10	0.34
황색 색소	0.30		7.3×10-2
청색 색소	0.98		0.24
미지시료 A	청색: 0.84 황색: 0.07		청색: 0.21 황색: 1.8×10-2
미지시료 B	적색: 1.21 청색: 0.88		적색: 0.29 청색: 0.22

*이동거리 값 소수점 아래 둘째자리

1. 세 가지 색소의 극성 크기 순서

1) 황색  2) 청색  3) 적색

실험 2. 컬럼 크로마토그래피에 의한 분리 결과와 극성 비교

1. 미지시료 A 용출 순서

1) 황색  2) 녹색(청색)

2. 미지시료 B 용출 순서

1) 적색  2) 청색

3. 세 가지 색소의 극성 크기 순서

1) 청색  2) 황색  3) 적색

실제: 1) 황색 2) 청색 3) 적색

Ⅶ. Discussion

1. 실험 관찰 결과

1) TLC(실험 1)에 대한 관찰 결과

전개를 진행하기 전에 적색, 황색, 청색을 사용했고 미지 시료 A, B의 색은 각각 녹색과 남색계열인 것을 관찰할 수 있었다. 첫 시도에서는 Butanol만 전개제로 사용했다. 하지만, 적색 색소를 제외한 모든 색소들이 전개가 전혀 되지 않았으며 적색의 전개조차도 매우 미비했다. 이는 시료들도 어느정도 극성을 가지고 있는데, 뷰탄올이 약간의 극성 원자단을 포함하고 있긴 하지만, 그 정도가 미미하여 용질을 충분히 용해하지 못했기 때문에 시료가 거의 고정상에만 머무른 것으로 예상된다. 용매강도의 관점으로 보자면 용매 강도가 너무 낮아 용매가 고정상을 벗어나지 못한 것으로도 생각할 수 있다. 보다 빠른 전개를 위해서 물과 뷰탄올, 그리고 아세트산을 일정 비율로 섞은 전개제를 사용했다. 용매 강도가 조절된 전개제를 사용하니 황색 색소를 제외하고는 전개가 진행되었다. 전개된 시료의 형상을 보니 시료가 지면에 대해 수직으로 올라가지 못했다. TLC plate의 세로축에대하여 눈에 보일 정도의 경사도를 가지고 전개가 된 것을 확인할 수 있었다.  또한 아세트 산을 사용했음에도 불구하고 꼬리 끌림 현상이 발생해서 정확한 전개 거리를 측정하기는 어려웠다. 결과상의 불완전함을 감안하여 중심점들에 대해 길이를 측정한 후 이동 거리를 구했다. 각 시료의 이동거리와 전개제의 이동거리를 고려하여 억제 인자 Rf의 값을 구할 수 있었다. TLC plate의 표면에는 극성 물질인 실리카 겔이 얇게 도포되어 있기 때문에, 더 작은 극성을 띠는 색소들이 더 높이 올라갈 수 있다. 따라서 Rf값이 가장 큰 적색 색소가 가장 극성의 크기가 작으며 그 다음으로는 청색이 그리고 황색 색소의 극성 크기가 가장 큰 것을 알 수 있었다. 또한 미지시료 A에서는 황색과 청색이 분리되었으며, 미지시료 B에서는 청색과 적색이 분리된 것을 관찰할 수 있었다. 그리고 미지시료를 구성하는 각 색소의 이동 거리는 단일한 색소가 이동한 거리의 경향과 같았으며 이동한 거리는 더 짧은 것을 확인할 수 있다. 이는 각 시료가 혼합될 때 분자간 인력이 작용하여 발생한 결과라고 예상된다.

2) 컬럼 크로마토그래피(실험 2)에 대한 관찰

정상 크로마토그래피를 진행하기 위해서 극성 물질인 실리카 겔을 고정상으로 하고 이동상으로 작은 극성을 갖는 뷰탄올을 전개제로 사용했다. 이 기법에서는 고정상이 항상 균일한 상태를 유지하는 것이 중요하다. 실리카 겔 사이에 공기가 들어가서 분리를 방해해서도 안되며, 실리카겔이 균일하게 녹지 않아서 분리의 정도에 차이가 발생해도 안되기 때문이다. 실리카겔의 균일함을 유지하기 위해서 실리카겔을 적실 때 2가지 점을 고려했다. 우선 실리카 겔에 뷰탄올(전개제)를 밀어 넣을 때 주사기의 피스톤을 최대한 조금 넣으려고 했다. 뷰탄올로 실리카 겔을 적시기 위해서 지나치게 피스톤을 깊게 집어넣으면 그만큼 피스톤을 빼내야 하는 거리도 증가한다. 피스톤을 뺄 때 주사기의 구멍을 통해서 공기가 유입되며 이는 실리카겔 사이에 공기가 들어가는 결과로 이어진다. 결국 뷰탄올을 넣었지만 그 속에 공기도 같이 들어가게 되어 균일한 고정상을 유지할 수 없게 된다. 또한 실리카 겔이 건조되어 공기가 유입되는 것을 방지하기 위해 뷰탄올의 메니스커스가 실리카 겔의 최상단보다 항상 위에 위치하도록 뷰탄올을 충분히 사용했다. 시료가 최대한 수평을 이루며 분리될 수 있도록 시료를 같은 양으로 뷰탄올 전면에 시료를 부었다. 시료를 부어 실리카 겔에 충분히 흡수되도록 한 후 다시 뷰탄올(이동상)을 부어 미지 시료의 분리를 진행했다. 미지 시료 A의 경우 확실하게 분리가 되지 않은 듯해 보였으나 하단부가 노랑 빛을 보이며 상단부가 비교적 푸른 빛을 보이는 것을 통해 황색 시료가 먼저 용출되었으며 그 다음으로 청색 시료가 후에 분리되는 것을 확인했다. 또한, 미지시료 B에 대해서는 적색 시료가 먼저 용출 되었으며 청색 시료가 후에 용출되는 것을 확인할 수 있다. 정상 크로마토그래피에서 극성 고정상을 사용하므로 먼저 용출되는 색소가 비교적 더 작은 극성을 나타내는 것을 알 수 있다. 이를 이용하면 미지시료 A에서 황색 색소가 청색 색소보다 더 작은 극성을 보이는 것을 확인할 수 있으며, 미지시료 B에서는 적색 색소가 청색 색소보다 더 작은 극성을 나타내는 것을 알 수 있다. 이 두 정보를 종합하면 청색의 극성이 제일 크며 실험 2의 결과만으로는 적색과 황색 색소의 극성 크기는 불가능하다고 판단했다.

2. 실험 정보 종합 및 오류 발생 이유 확인과 개선

1) 실험 정보의 종합

실험 1과 실험 2의 정보를 통해서 미지시료에 대한 정보와 각 시료의 정보를 분석할 수 있었다. 미지시료가 어떤 색소로 구성되었는지 살펴보기에는 컬럼 크로마토그래피보다는 TLC를 이용했을 때 더 수월했다. 색의 삼원색은 마젠타(적색), 노랑(황색), 그리고 시안(청색)이 해당한다. 이를 기반으로 미지 시료의 색을 관찰해본 결과 초록(시안과 황색의 혼합), 남색계열(마젠타와 시안의 혼합)인 것을 알 수 있었다. 실제로 TLC를 진행해본 결과 미지시료 A가 황색과 청색, 그리고 미지시료 B가 청색과 적색 색소로 명확하게 구분되는 것을 통해서 미지시료 A의 조성은 황색과 청색 색소, 그리고 미지시료 B의 조성은 청색과 적색 색소인 것을 알 수 있었다. 시료의 조성은 큰 무리없이 분석할 수 있었지만, 각 시료가 갖는 극성의 크기를 비교할 때는 어려움이 존재했다. 두 실험결과와 실제 나왔어야 하는 결과가 어떤 차이점을 보이는지 밑의 표를 통해서 살펴보자.

	극성 크기 제일 큼	극성 크기 중간	극성 크기 제일 작음
이론적 수치	황색 색소	청색 색소	적색 색소
실험 1 (TLC)	황색 색소	청색 색소	적색 색소
실험 2 (컬럼 크로마토그래피)	청색 색소	황색 색소 또는 적색 색소

TLC에서 황색 색소가 거의 분리가 안되는 것처럼 보여 실험상 오류가 발생했다고 생각되었지만, 실제 결과와 상충되는 부분이 없었다. 오히려 컬럼 크로마토그래피를 진행했을 때 나타난 결과와 이론적으로 나왔어야 하는 결과가 상충하는 것을 확인할 수 있다.

2) 실험 결과에서 오류가 발생한 이유에 대한 고찰 및 보정

① TLC

ⅰ) 오차원인 분석

얇은 층 크로마토그래피를 진행할 때 크게 2가지 문제점이 있었기 때문에 올바른 실험 결과를 얻지 못했다 첫 번째로 제조한 전개제가 모든 시료를 분리하지 못했다. 뷰탄올과 물에 대해서 색소는 특별한 반응을 보이지 않으므로, 아마 아세트산의 작용으로 인하여 황색 색소가 이동하지 못했음을 생각해볼 수 있다. 또한 TLC plate의 가로 길이게 비커의 크기에 비해 약간 컸다. 그래서 TLC plate가 완전히 수평으로 있지 못하고 오른쪽으로 약간 기울었기 때문에 전개가 정확하게 발생하지 않았다.

ⅱ) 발생한 오류 값에 대한 보정

용매가 전개되는데 용질이 따라 올라가는 비율은 거의 일정하기 때문에 Rf값에 큰 영향을 미치지못한다. 지오지브라 프로그램을 이용해서 경사진 각도를 구하고 세로에 대한 정사영 값을 구해 Rf값을 구해도 수치의 변화도 거의 없으며 극성의 크기 변화에 영향을 주지 못함을 확인할 수 있다. 보정Rf는 가정된 수직 이동거리에 대해 값을 구하는 것이므로 다음과 같이 표현할 수 있다.

\[R_{f,fixed}=\frac{용매의\,이동거리\times cos(경사각)}{이동상의\,이동거리}=R_f \times cos(경사각)\]

변화 수치를 정확하게 보기 위해서 유효숫자를 무시하고 소수점 아래 넷째자리까지 표현했다.)

	경사각 ($\circ$)	실험 Rf	보정 Rf
적색 색소	5.34	0.34	0.3385
황색 색소	∙		∙
청색 색소	11.337	0.24	0.2353
미지시료 A	24.257	청색: 0.21 황색: 0.018	청색: 0.1914 황색: ∙
미지시료 B	27.257	적색: 0.29 청색: 0.22	적색: 0.2578 청색: 0.1955

또한 올바른 전개제를 사용해서 시료가 올바르게 분리되었다면 아래와 같은 결과를 얻을 수 있을 것이다.

② 컬럼 크로마토그래피

ⅰ) 오차원인 분석

미지시료 A에 들어있는 두 색소에 대해서 어떤 색소를 섞었는지 구분이 힘들었다. 이 때문에 미지 시료를 구성하고 있는 색소에 대해 극성의 차이를 명확하게 결정짓지 못했다. 실험을 진행할 때, 그리고 결과를 해석할 때 고려하지 않은 부분이 있었기에 잘못된 결과를 얻었다고 생각했다. 우선 실험 과정에서 발생한 문제점에 대해서 살펴보도록 하자. 분리를 위해 만든 칼럼의 길이에 비해서 분리하려고 했던 시료의 부피가 지나치게 컸기 때문에 실험 시간 동안 완전한 분리를 하지 못했다. 이번 실험을 하며 고정상(실리카 겔)이 마르지 않도록 뷰탄올의 메니스커스를 실리카 겔보다 높은 위치에 유지하도록 했어야 했다. 이 위에 미지시료를 넣을 때 뷰탄올과 실리카 겔이 충분히 실리카겔에 흡수된 후에 다시 뷰탄올을 부어야 한다. 이를 고려하지 않고 뷰탄올을 넣었기 때문에 뷰탄올에 시료가 섞여 분리해야 하는 미지시료의 부피가 증가했다. 결국 넣어준 시료의 양에 비해 분리해야 하는 시료의 양이 급증했기 때문에 분리를 위해 필요한 컬럼의 길이도 증가했으며 필요한 시간도 증가하게 되었다. 분리에 충분한 컬럼의 길이도 확보하지 못했고 또 완벽한 분리가 될 때까지 충분히 기다리지 않았기 때문에 명확한 분리 결과를 얻지 못했다. 두 번째로는 진행한 실험의 결과를 해석할 때의 다양한 변수를 생각하지 않고 보이는 결과만 이용해서 해석했기에 문제가 발생했다. 이번 실험 결과를 해석할 때 단순히 노란 계열 색이 컬럼의 하단부에 보였다는 것을 근거로 극성의 크기가 청색 색소가 더 크다고 판단했다. 하지만 ‘분리한 시료의 불균일성’에 대해서 고려하지 못했다. 진행을 분리한 시료는 황색 색소와 청색 색소로 이루어진 미지시료 A다. 이때 분리를 위해서 뷰탄올을 섞었기 때문에 분리가 된 시료가 완벽한 균일 혼합물이라고 판단하기 힘들다. 흙탕물과 같은 불균일 혼합물에서 같은 양의 모래를 섞었더라도 혼합물의 형상이 달라질 수 있다. 이번에 진행된 미지시료도 마찬가지이다. 시료가 전개제에 의해 불균일하다면 완벽한 분리가 발생했다고 판단하지 못한다면 그 시료가 눈에 보이는 것만으로는 어떤 상태에 놓여있는지 명확하게 규명할 수 없다. 이를 고려하지 않고 단순히 황색 색소가 밑에 있다는 관찰 사실만 가지고 실험을 다시 해보지 않고 결과를 확정했기 때문에 이상적으로 실험을 진행했을 때 얻을 수 있던 결과와 모순이 발생했다.

 

ⅱ) 발생한 오류 값에 대한 보정

이를 반영해서 올바르게 실험을 진행하면 아래와 같은 분리 형태 결과를 얻을 수 있다.

올바른 결과를 이용하면 실험 2만 진행했더라도 극성의 크기 비교를 할 수 있었을 것이다. 미지시료 A를 분리해본 결과 황색 색소의 극성이 청색 색소보다 더 큰 것을 알 수 있다. 또한 미지시료 B를 분리한 결과 청색 색소보다 적색 색소의 극성이 더 작은 것을 알 수 있다. 이 두 사실을 조합하면 극성의 크기를 큰 순서대로 나열하면 황색-청색-적색인 것을 확인할 수 있었을 것이다.

 

Ⅷ. Reference

1. 대한화학회, 표준 일반화학실험 제 7판, 천문각, 2011, pp. 73~82

2. 오도석, CHROMATOGRAPHY 1st reviced edition, 학술편수관, 2012. pp. 13~15, 82~83, 282~287